过表达Pseudomona...始相关蛋白提高菌体繁殖速度_范旭.pdf

南 开 大 学 学 报（自然科学版）Acta Scientiarum Naturalium Universitatis NankaiensisVol.561Feb.2023第56卷第1期2023年2月范旭等：过表达Pseudomonas mendocina复制起始相关蛋白提高菌体繁殖速度文章编号：0465-7942(2023)01-0019-07过表达Pseudomonas mendocina复制起始相关蛋白提高菌体繁殖速度范旭,赵风杰,乔明强,杨超(南开大学 分子微生物与技术教育部重点实验室,天津 300071)摘要：复制起始蛋白DnaA通过识别复制起始位点oriC上的特殊序列,并招募复制复合体起始复制,它通过绑定ATP或ADP来对复制起始的开始进行调节.DNA聚合酶III的亚基DnaN蛋白,负责将DNA聚合酶III连接到已经解旋的DNA上,以开始复制过程.通过过表达复制起始相关蛋白DnaA和DnaN,促进了菌体的繁殖能力,优化了菌体的生长状态,缩短了菌体倍增时间,为构建Pseudomonas mendocina工程菌株提供了参考.关键词：Pseudomonas mendocina;复制起始蛋白;生长速度;扫描电镜;菌体倍增时间中图分类号:Q93文献标识码:A0引言染色体的复制起始是进化上保守的过程1,不同生物体的启动机制非常类似2.标准的细菌基因组是单个环状染色体3,包含单一复制起始位点oriC,并从oriC开始双向复制4.DnaA蛋白负责复制的起始5,可以结合ATP和ADP6.DnaA-ATP有起始活性,并促进oriC的解旋7,但DnaA-ADP无活性8.oriC上的DnaA识别位点很多,包含3个高效的(DnaA-ATP/DnaA-ADP均结合)和几个低效的(仅DnaA-ATP结合)9-10.复制过程受到高度控制,原则上所有细胞开始复制于同一细胞周期,并且一个细胞循环只开始一次11.在大多数细菌中,复制起始于DnaA蛋白识别结合特殊序列复制起始位点(oriC)内的DnaA boxes12.DnaA直接结合并打开oriC,引起双链DNA解开13,提供一个单链模板以招募解旋酶载体及其搭载的复制解旋酶14.起始过程的严格调控依赖于起始时DnaA-ATP的暂时增多和起始开始后的迅速降解15-16.起始开始后,oriC由于GATC位点半甲基化而暂时失活17.这种隔离持续1/3倍增时间,以便将DnaA-ATP水解为DnaA-ADP18.下一轮复制开始时,DnaA-ADP重新激活为DnaA-ATP形式19.另外由于细胞内ATP含量比ADP高,刚合成的DnaA更倾向于形成DnaA-ATP20.在对数生长期最佳条件下,每个菌体细胞可以完成一轮以上的复制,这种情况被称为多叉复制21.DnaN蛋白,即DNA聚合酶III的亚基,作为所谓的滑动钳将DNA聚合酶III连接到解旋的DNA上22,以开始其高持续合成能力,随着polIII全酶的完整组装,互补链DNA的合成随之发生23.同时,DnaN对于引发蛋白DnaA的负调节亦是必需的24.通过加速水解与DnaA结合的ATP,发生DnaA失活;生成的ADP-DnaA无法启动下一轮复制25.因此,通过复制酶的作用对启动子进行调节,可能是有效控制复制周期的关键机制.提高菌体繁殖速度,优化菌体各方面性能一直是生物工程菌株研究课题,有利于增加工业生产中菌体量及产物产量,以进一步降低生产成本,提高经济效益.复制起始相关蛋白DnaA和DnaN,作为DNA复制及菌体增殖的关键作用因子,其含量增加,或许有利于菌体自身的代谢及增殖,以改善并提高工程菌株生长特性.以本室分离菌株Pseudomonas mendocina NK-01作为目标菌株,对其进行基因工程改造,利用表达质粒pBBR322,结合菌株的内源强启动子P4,分别过表达了复制起始蛋白DnaA和DNA聚合酶III的亚基DnaN,提高了菌体的繁殖速度,缩短了菌体的倍增时间,影响了菌体形态,为进一步在NK-01中进行代谢工程改造以提高产物产量产生了积极的作用.收稿日期：2022-06-14基金项目：国家自然科学基金面上项目（31470123）作者简介：范 旭(1992-),女,天津人,博士研究生.通讯作者：杨 超(1979-),男,天津人,教授,研究方向:微生物代谢工程方面的研究.E-mail: 20 南 开 大 学 学 报（自然科学版）第56卷1材料与方法1.1 菌株、质粒及引物（1）菌株:Pseudomonas mendocina strains:NKU(Parent strain,Cm+)来自本实验室,NKU-pBBR(NKU insert with the plasmid pBBR322),NKU-dnaA(KU insert with the plasmid pBBR-dnaA),NKU-dnaN(NKU insert with the plasmid pBBR-dnaN),NKU-P4-dnaA(NKU insert with the plas-mid pBBR-P4-dnaA),NKU-P4-dnaN(NKU insert with the plasmid pBBR-P4-dnaN).E.colistrains:DH5(F-,80dlacZM1,(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,-thi-1,gyrA96,relA1),以上均来自于本实验.(2)质粒:pBBR322(Km+)来自本实验室,pBBR-dnaA（pBBR322 insert with the gene dnaA）,pB-BR-dnaN(pBBR322 insert with the gene dnaN),pBBR-P4-dnaA(pBBR-dnaA insert with the pro-moter P4),pBBR-P4-dnaN(pBBR-dnaN insert with the promoter P4),以上均来自于本实验.(3)引物:PBBR+A-UP(5-GCTCTAGAACTAGTGGATCCGTGTCAGTGGAACTATGGCA-3),PBBR+A-DW(5-TCCTGCAGCCCGGGGGATCCTCAGGTTGTAAGCGTACGCA-3),PBBR+N-UP(5-GCTCTAGAACTAGT-GGATCCATGCATTTCACCATTCAACG-3),PBBR+N-DW(5-TCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTACAGACG-CATCGGCATGA-3),up-XbaI-P4(5-CACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGAGGTTTCCTGTGGTGAGCA-3),P4-R-dw-N(5-AAATGCATGGATCCACTAGTCCTCCTTGTGGGCGTGTCAGCTTGGAC-3),P4-R-dw-A(5-ACTGACACGGATCCACTAGTCCTCCTTGTGGGCGTGTCAGCTTGGAC-3).1.2 菌株的构建及培养研究室前期筛选了一系列NK-01内源强启动子,P4对下游基因的表达水平增强效果最为明显.本研究将P4强启动子插入dnaA和dnaN上游,以增强其转录及表达.由于采用了质粒过表达的方式,为了维持质粒稳定性,在所用培养基LB和M9(添加0.4%葡萄糖)中,添加了氯霉素和卡那霉素,其终浓度为170和5 g/mL.1.3 qPCR实验将在LB和M9中培养好的菌株,取相等量菌体细胞,分别提取RNA(每种3个平行),进行反转录至cDNA,以16s作为对照,进行real-time PCR,并分析其结果.1.4 SDS-PAGE实验在LB和M9中培养好的菌株,将OD值调节一致,分别收集20 mL菌体细胞,离心后用5 mL的PBS(NaCl 8 g/L,KCl 0.2 g/L,Na2HPO4 12H2O 3.58 g/L,KH2PO40.272 g/L)重悬细胞,加入 2 LPMSF,超声破碎约10 min,离心取上清液,经过OD595定量蛋白含量一致后,进行蛋白电泳.1.5 电镜将在LB或M9培养基中培养至对数期末期的菌体,离心并收集,PBS清洗6遍后,用3%戊二醛固定过夜,PBS清洗5次以去除残留戊二醛后,梯度乙醇浸泡脱水,冷冻干燥过夜,样品表面喷金后,进行扫描电镜观察.1.6 生长曲线100 mL摇瓶培养待测菌株,每种菌株3个平行.在LB中每2 h取1/0.5/0.25 mL样品,稀释至1 mL后测定OD600的数值,以表征菌体浓度.在M9培养基中,每3 h取一次样.1.7 菌体倍增时间在LB和M9液体培养基中分别培养待测菌株,在OD6000.1-0.6区间内,每15 min取1 mL样品,测定OD600的数值,拟合直线,斜率即为菌体倍增时间.每种菌株3个平行,R20.95.2结果与分析2.1 dnaA和dnaN的过表达以带有upp反向筛选标记NK-01upp(NKU)作为出发菌株,在表达质粒pBBR322上分别插入dnaA和dnaN,并在其前端插入内源强启动子P4,构建过表达菌株NKU-dnaA和NKU-dnaN.质粒结构如图1所示.PCR检测结果显示载体构建成功,在构建完成的载体中,可以PCR得到内源强启动子P4分别融合dnaA和dnaN的片段,而pBBR322的空白载体则无法得到任何片段.qPCR结果表明,在LB培养基中,NKU-dnaA菌株的dnaA转录水平明显提高,相较于 NKU 提高了 32 倍,而 NKU-dnaN 菌株 dnaN 转录水平也提高的较为明显,但比dnaA过表达菌株稍低,提高了18倍.如图2所示.M9添加0.4%葡萄糖培养基中,NKU-dnaA菌株dnaA转录水平提高倍数明显下降,相较于NKU提高了12倍,相反,NKU-dnaN菌株dnaN转录水平提高倍数却略有上升,相较于NKU提高了23倍.如图3所示.SDS-PAGE的结果表明,在LB培养基中,NKU-dnaA菌株中的DnaA蛋白含量相较于NKU明显提高,并且受到DnaA蛋白调控的其他复制起始蛋白,以及受到复制起始活其他蛋白,含量也都明显增加,但LB培养基中NKU-dnaN菌株的DnaN蛋白含量相较于NKU并无明显变化.而在M9培养基中,无论是过表达dnaA的NKU-dnaA菌株,还是过表达dnaN的NKU-dnaN菌株,其细胞内蛋白水平相较于NKU整体增加,增加幅度不如LB中NKU-dnaA菌株那样明显.SDS-PAGE结果如图4所示.以上结果说明,LB这种营养丰富的培养基中,菌体在对数生长期很会进行多叉复制,即在上一轮DNA复制未能完全完成情况下,下一轮DNA复制已经开始,所以负责起始复制DnaA蛋白,其转录水平和表达水平均明显增多,以更好适应菌体多叉复制需要.由于DNA的复制过于活跃,细胞内的能量尤其是ATP需要大量供给复制过程,导致菌体内的其他蛋白表达水平略有下降.负责连接DNA聚合酶III的DnaN蛋白，行使功能在一定程度上依赖DnaA等复制起始蛋白，转录水平和表达水平在一定程度上受到调节控制，所以NKU-dnaN菌株DnaN蛋白，由于基因拷贝数增加,转录水平比初始菌株NKU有所提高,但并不如NKU-dnaA菌株DnaA蛋白那样明显,表达水平相较NKU并无明显增加.M9添加0.4%葡萄糖这种营养相对匮乏培养基中,由于营养环境限制,菌体本身无法进行多叉复制,即一个细胞个体中只能完成一轮复制,负责起始复制DnaA蛋白,受到复制起始机制一系列负反馈调节,其转录水平和表达水平相较于NKU,由于基因拷贝数增加而有所提高,但不如LB培养基中明显.同样,受到制约的DnaN蛋白其表达水平仅是略有提高,由于其具有促进DnaA-ATP水解为DnaA-ADP的作用,PBBR1MCS-2图 1 插入质粒构建示意图Fig.1 Insert plasmid construction schematicKmreplacZP4dnaAmobmobmobKmKmP4d