海产源多重耐药共生菌的耐药表型及耐药基因分析_吴书香.pdf

第 14 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.2 2023 年 1 月 Journal of Food Safety and Quality Jan.,2023 基金项目:中国水产科学研究院基本科研业务费项目(2020TD71)、中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费项目(20603022020004)Fund:Supported by the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund,CAFS(2020TD71),and the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund,YSFRI,CAFS(20603022020004)*通信作者:江艳华,高级工程师,主要研究方向为水产品中生物危害物检测与控制。E-mail: 王 鹏,教授,主要研究方向为海洋微生物。E-mail:*Corresponding author:JIANG Yan-Hua,Senior Engineer,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,No.106,Nanjing Road,Qingdao 266071,China.E-mail: WANG Peng,Professor,Ocean University of China,No.5,Yushan Road,Qingdao 266003,China.E-mail:pengwang 海产源多重耐药共生菌的耐药表型及 耐药基因分析 吴书香1,2,李丽倩2,姚 琳2,王联珠2,曲 梦2,李风铃2,谭志军2,3,江艳华2*,王 鹏1*(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,青岛 266003;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部水产品 质量安全检测与评价重点实验室,青岛 266071;3.青岛海洋科学与技术试点国家实验室,青岛 266033)摘摘 要要:目的目的 对市售牡蛎和大黄鱼中分离的多重耐药共生菌进行耐药性分析、全基因组测序及耐药基因分析。方法方法 采用药敏纸片法进行耐药性分析,采用二代测序技术进行基因组框架图测序,通过与 CARD 数据库比对进行耐药基因分析。结果结果 菌株呈现高度的多重耐药性,对 10 种或 10 种以上药物耐药,多重耐药系数大于或等于 0.48,所有菌株对头孢唑啉、萘啶酸、四环素、复方新诺明及氯霉素耐药。分离菌株为水产品中常见共生菌,基因组差异显著。菌株含有-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、氯霉素类、消毒剂类等药物的耐药基因,与耐药表型基本一致,部分菌含有对同一类药物具有不同耐药机制的多个基因。结论结论 牡蛎和大黄鱼中存在多重耐药共生菌,耐药基因丰富,如果耐药基因传播到致病菌会造成临床治疗失效,具有潜在的危害。关键词关键词:耐药性;耐药基因;共生菌;全基因组测序;牡蛎;大黄鱼 Analysis of antimicrobial resistance phenotype and genotype of multiple-antimicrobial resistant commensal bacteria from marine products WU Shu-Xiang1,2,LI Li-Qian2,YAO Lin2,WANG Lian-Zhu2,QU Meng2,LI Feng-Ling2,TAN Zhi-Jun2,3,JIANG Yan-Hua2*,WANG Peng1*(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;3.Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266033,China)ABSTRACT:Objective To analyze the antimicrobial resistance,whole genome sequence and antimicrobial resistance genes of multiple-antimicrobial resistant commensal bacteria isolated from commercially available oysters DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.02.027第 2 期 吴书香,等:海产源多重耐药共生菌的耐药表型及耐药基因分析 249 and large yellow croaker.Methods Antimicrobial resistance was performed by disk diffusion method,draft genome was sequenced by next-generation sequencing technology,and antimicrobial resistance genes were obtained by aligning the genome sequences to the CARD database.Results The strains showed a high degree of multiple resistance to 10 or more antimicrobials,with a multiple antimicrobial resistance index equal to or greater than 0.48.All strains were resistant to cefazoline,nalidixic acid,tetracycline,sulphamethoxazole/trimethoprim,and chloramphenicol.The isolates were commensal bacteria commonly found in aquatic products,and their genomic sequences were significantly different.The strains contained the resistance genes related to-lactams,aminoglycosides,quinolones,tetracyclines,sulfonamides,chloramphenicol,disinfectants,etc.,which were basically consistent with the resistance phenotypes.Some strains had several genes with different resistance mechanisms for the same class of antimicrobial.Conclusion Multiple-antimicrobial resistant commensal bacteria are present in oysters and large yellow croaker and rich in lots of resistance genes.These bacteria and resistance genes may be the potential hazards if the resistance genes transfer to the pathogens and jeopardize the treatment of infections.KEY WORDS:antimicrobial resistance;antimicrobial resistance gene;commensal bacteria;whole genome sequencing;oyster;large yellow croaker 0 引 言 抗菌药的过度使用导致全球细菌耐药性日益严重,已成为全球公共卫生的主要威胁之一。当今耐药菌形势非常严峻,细菌耐药性会造成临床用药的失效,据估计,全球范围内由耐药菌引起的死亡人数约 70 万,预计到 2050年,死亡人数将高达一千万,超过癌症导致的死亡人数1。细菌耐药性给全球经济带来巨大压力,据估计,到 2050 年经济损失将高达 100 万亿美元2。我国是水产养殖大国,抗菌药在防治水产动物疾病方面发挥了重要作用,然而仅20%30%的抗菌药被吸收利用,其余的抗菌药会随着食物残渣和粪便排放,最终进入水环境而在不同水生动物体内再次积累,导致污染的水环境成为巨大的耐药基因池36。以往的研究重点关注致病菌的耐药性,然而环境中绝大多数菌为非致病性的共生菌,且环境中非致病共生菌耐药情况更为严峻710。共生菌携带的耐药基因大部分位于质粒、转座子、整合子等可移动基因元件上,耐药基因会随着这些基因元件发生水平转移,当转移到食源性致病菌上,人体感染后会给临床治疗带来巨大挑战。如果耐药菌随着食物进入人体肠道,会使肠道微生物产生耐药性,从而危害人体健康1113。由于特殊的生活环境,水产品极易富集水体中的微生物,因此,开展水产品中共生菌的耐药性及耐药机制研究,对于防范耐药基因的传播扩散,保障我国水产品的安全和人类健康具有重要意义。目前,关于水产品中共生菌耐药性的研究主要是通过药敏试验分析表型、通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术获得耐药基因,使用的药物种类和获取的耐药基因有限。因此,本研究针对来源于 2 种典型养殖海产品牡蛎和大黄鱼中的6株耐药共生菌,基于全基因组测序技术获得菌株中所有耐药基因的分布特征,全面反映菌株的耐药情况及耐药机制,为进一步开展水产品中共生菌的耐药形成、传播机制和控制技术研究奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌 株 6株多重耐药菌,通过多重药物平板分离自2021年从青岛市农贸市场采集的活牡蛎(可食部分)和冰鲜大黄鱼(肌肉组织)中,其中 ML1、ML2、ML3 来源于牡蛎,HY1、HY2、HY3 来源于大黄鱼。1.1.2 培养基与试剂 2216E 液体培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司);2216E 固体培养基:2216E 液体培养基中添加1520 g/L 琼脂粉;Mueller-Hinton(MHA)固体培养基(北京陆桥技术股份有限公司);21 种抗生素药敏纸片(英国OXOID 公司),药物种类和浓度见表 1;细菌基因组提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司);Hieff NGS MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina(上海翌圣生物科技有限公司);QubitdsDNA HS Assay Kit(美国 Thermo Fisher Scientific 公司);Hieff NGS DNA Selection Beads(上海翌圣生物科技有限公司);琼脂糖(西班牙 Biowest 公司)。1.2 仪器设备 NU-425-6