哈茨木霉菌HNA12在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用_张丽芳.pdf

农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022，41（12）:2688-26932022年12月张丽芳，许旖旎，曹阳，等.哈茨木霉菌HNA12在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用J.农业环境科学学报,2022,41（12）：2688-2693.ZHANG L F,XU Y N,CAO Y,et al.Trichoderma harzianum HNA12 and its application in controlling aflatoxin contamination in maizeJ.Journal of Agro-Environment Science,2022,41（12）：2688-2693.开放科学OSID哈茨木霉菌HNA12在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用张丽芳1，许旖旎1，曹阳1，刘力强2（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003；2.河北科技大学，石家庄 050018）Trichoderma harzianum HNA12 and its application in controlling aflatoxin contamination in maizeZHANG Lifang1,XU Yini1,CAO Yang1,LIU Liqiang2（1.Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College,Huai an 223003,China;2.Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China）Abstract：To control mycotoxin contamination from the source,high throughput screening and biological control of antagonisticmicroorganisms against aflatoxin contamination of maize were carried out in this study.In total,1 055 strains of Trichoderma were isolatedfrom healthy maize seeds collected from Jiangsu,Shandong,Shanxi and Henan provinces.Among them,10 isolates showed antagonisticactivity with a band width of more than 8 mm,and the inhibition rate was ranged from 36.5%to 90.0%.Vivo experiments showed that 7Trichoderma strains had potent inhibitory effects against A.flavus with a rate of 44.2%to 87.0%,and the inhibition rate against aflatoxinranged from 40.5%to 85.0%.Among the strains tested,the control efficiency of HNA12,T40-3,and T85-5 against A.flavus was 87.0%,68.8%,and 64.5%,respectively.The strains with the highest inhibition rates of 85.0%,75.2%,and 68.5%against aflatoxin were HNA12,T21-1,and T40-3,respectively.Field trial results showed that HNA12 had the highest growth promotion and aflatoxin inhibition rates of10.5%and 90.5%,respectively,indicating a great potential for biocontrol.Based on morphological and molecular biological analyses,strain HNA12 was identified as Trichoderma harzianum.Antagonistic mechanism test showed that the fermentation product and the proteinextract of the strain HNA12 had a strong inhibition ability on the growth of A.flavus,and it could be used as a microbial agent with broadapplication prospect.Keywords：maize;mytotoxin;contamination;wood fungus;biological control收稿日期：2022-10-24录用日期：2022-11-22作者简介：张丽芳（1977），女，硕士研究生，副教授，从事食品微生物学及发酵研究。E-mail：摘要：为从源头控制真菌毒素污染，本实验开展了玉米黄曲霉毒素污染拮抗微生物高通量筛选及生物防治研究。从江苏、山东、山西和河南等主产区的健康玉米籽粒内分离到 1 055株木霉菌，其中，10株木霉菌拮抗带宽超过 8 mm，抑制率为 36.5%90.0%。活体实验发现，7株木霉对黄曲霉菌有较强的抑制作用，抑制率为44.2%87.0%，对黄曲霉毒素污染的抑毒率为40.5%85.0%。试验菌株中，HNA12、T40-3和T85-5对黄曲霉菌的防治效果最高，分别达到87.0%、68.8%和64.5%，HNA12、T21-1和T40-3抑毒率最强，分别达到85.0%、75.2%和68.5%。田间试验显示，菌株HNA12的促生率及抑毒率最高，分别达到10.5%及90.5%，生防潜力巨大。经形态学及分子生物学分析，菌株HNA12被鉴定为哈茨木霉。拮抗机制实验证明，菌株HNA12发酵产物及其蛋白提取物对黄曲霉菌生长有较强的抑制能力，可以作为微生物制剂开发应用。关键词：玉米；真菌毒素；污染；木霉菌；生物控制中图分类号：TS201.3文献标志码：A文章编号：1672-2043（2022）12-2688-06doi:10.11654/jaes.2022-1056张丽芳，等：哈茨木霉菌HNA12在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用2022年12月玉米是世界上重要的粮食作物和经济作物，对世界粮食安全具有重要的影响。玉米从播种、收获、储藏、运输、加工到消费等各个环节都可能受到黄曲霉等不同真菌毒素的污染，因此对于黄曲霉毒素的控制依然是一个世界性的难题。黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉、烟曲霉等曲霉属真菌产生的一种真菌毒素，其理化性质和结构相当稳定1。全世界每年因黄曲霉毒素污染造成的经济损失在百亿美元以上，特别是玉米、花生、油菜和水稻等作物受到的危害最大，影响最广2-3。黄曲霉毒素具有极强的致癌性、致畸性、致突变性和毒性，食用黄曲霉毒素污染的农产品会导致人畜机体病变甚至死亡，严重威胁人体健康1，已引起世界各国的广泛重视，因此，加强玉米等农产品中黄曲霉毒素污染的防控刻不容缓。黄曲霉对玉米等作物的侵染及其毒素污染发生在生长、储运和加工的各个环节，防控难度较大。但农作物及其产品中的黄曲霉菌主要来自田间和生长期间，因此开展黄曲霉毒素污染的源头控制尤为关键。目前，在玉米等农作物的生产中，黄曲霉毒素污染主要以化学防控为主，但化学防治污染环境，对农业生态环境造成严重破坏，同时黄曲霉菌极易产生抗药性，因此，寻找对环境安全、对人体健康无害的控制措施逐渐受到青睐4。目前，已经发现自然界存在许多种真菌和细菌能够控制黄曲霉对作物的侵染和毒素污染，降低农产品中生物毒素的污染水平。利用有益微生物来控制农产品中的生物毒素污染，不仅不会导致农产品质量安全降低、不会破坏生态环境，而且能够显著降低毒素污染，其中一些功能微生物还能提升农产品品质和产量。目前，国内外主要利用功能微生物来防控玉米的病虫害，但用来控制黄曲霉侵染和毒素污染的研究报道较少，为此，我们开展了玉米黄曲霉毒素污染生物防控研究，以期为我国农产品真菌毒素污染控制提供一个新的视角和途径。1材料与方法1.1 试验材料黄曲霉菌菌株由本实验室从不同种植区域的玉米籽粒中分离。木霉从我国不同主产区玉米籽粒中筛选获得。供试的玉米品种为郑单958。1.2 拮抗木霉分离从采自于江苏、河南、山东等主产区的健康玉米籽粒中分离木霉菌。首先，用3%的次氯酸钠溶液浸泡玉米籽粒，表面灭菌5 min，然后用无菌蒸馏水冲洗35次，待水分晾干后将籽粒用镊子捏碎放置于PDA平板上进行培养，在28 培养箱中培养5 d，每天观察菌落的生长状况，挑取木霉单菌落转接到PDA平板上进行纯化培养，同时对木霉菌进行编号和保存5。1.3 拮抗菌离体筛选利用对峙培养法开展拮抗木霉菌的筛选。将预先培养的黄曲霉菌碟放置于平板的中央，然后用移液枪吸取0.5 mL木霉孢悬液（1106CFUmL-1），等距离接种在PDA平板上，然后放置于28 培养箱中进行培养，重复3次，7 d后观察拮抗效果。筛选出拮抗效果较好的菌株在玉米籽粒上进行活体拮抗实验。1.4 拮抗木霉活体筛选1.4.1 发酵液制备利用接种针挑取拮抗效果较强的木霉菌株接种到内含50 mL PD（马铃薯葡萄糖液体培养基）培养液的三角瓶中进行发酵培养，于 28 150 rmin-1振荡培养35 d，得到种子液；利用移液枪吸取 1 mL 种子液（1.0108CFUmL-1）至含有50 mL PD的三角瓶中，于28 150 rmin-1振荡培养57 d，制备拮抗木霉菌发酵液。1.4.2 拮抗木霉活体筛选将培养7 d的拮抗木霉菌和黄曲霉菌发酵液（孢子最终浓度为3.0106CFUmL-1）分别接种到玉米籽粒中（各浸种5 min），然后放置于无菌平板中，每个平板1020颗玉米籽粒。在温度28，湿度7080的光照培养箱中培养57 d。以不接种木霉处理为对照，每个处理3个重复。1.5 大田试验田间试验在江苏食品药品职业技术学院实验基地完成，试验设置3个处理，即拮抗木霉菌处理（含孢子1106个 g-1）、化学农药处理（70甲基托布津可湿性粉剂）及空白对照，每个处理3次重复，每个小区面积为90 m2（15 m6 m）。木霉菌在玉米播种时随基肥一起施入，化学农药采取玉米籽粒拌种的方法施用。每个小区采用五点取样的方式，每个点取1020株玉米，详细调查玉米上黄曲霉毒素污染防控效果。抑毒率=（对照毒素量-处理毒素量）/对照毒素量100玉米促生率=（对照株高-处理株高）/对照株高1001.6 木霉菌鉴定真菌目前主要有两种分类鉴定技术，一种是基于2689农业环境科学学报第41卷第12期真菌的形态学特征等指标进行分类，一种是基于分子生物学手段进行鉴定，但这两种方法都存在不足之处。为了能够快速、准确和高效地对真菌进行分类鉴定，本实验结合两种分类方法进行鉴定，以提高真菌鉴定的准确率。1.6.1 木霉形态学鉴定形态学分类鉴定主要依据真菌的孢子形态、大小、纹饰、时间、颜色、菌落特征和生长速度等指标完成6。1.6.2 分子生物学鉴定木霉菌分子生物学鉴定中DNA扩增所用引物为ITS4（5-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3），ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G-3）。PCR反应体系：10Taq reaction buffer 缓冲液 5.0 L，dNTP（2.5 molL-1）4.0 L，引物