鬼针草提取物对食道癌细胞的抑制作用及其机理研究_王洁如.pdf

第43卷第6期Vol.43 No.62022年12月Dec.2022韩 山 师 范 学 院 学 报Journal of Hanshan Normal University收稿日期：2022-01-20基金项目：广东省粤东药食资源功能物质与治未病研究重点实验室（项目编号：2021B1212040015）；2020年广东大学生“攀登计划”专项（项目编号：pdjh2020b0376）；韩山师范学院一般科研项目（项目编号：LY202601）作者简介：王洁如（1999-），女，广东东莞人，韩山师范学院生命科学与食品工程学院2018级学生张振霞为通讯作者鬼针草提取物对食道癌细胞的抑制作用及其机理研究王洁如，劳雅诗，曾鑫海，梁惠芬，刘亚群，杨东娟，郑玉忠，张振霞（韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州521041）摘要：采用MTT法和细胞黏附研究鬼针草提取物对KYSE150增殖和黏附的影响，通过荧光定量PCR技术分析促凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA表达量的变化，采用蛋白免疫印迹法检测鬼针草提取物对凋亡相关蛋白（BAX）表达量的影响结果表明，鬼针草提取物能够抑制食道癌细胞的增殖，降低癌细胞黏附作用、破坏细胞间的信息交流，其抑制作用呈现剂量依赖关系；同时，鬼针草提取物可刺激促凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA表达，促使BAX蛋白表达增加，呈现剂量依赖关系，进而引起细胞凋亡可见，鬼针草提取物具有抑制食道癌细胞增殖和黏附的作用，并能通过刺激相关促凋亡基因的表达，诱导细胞凋亡关键词：鬼针草；食道癌；增殖；黏附；抑制；凋亡中图分类号：Q 256文献标识码：A文章编号：1007-6883（2022）06-0038-07DOI：10.19986/ki.1007-6883.2022.06.006食道癌又称食管癌，是常见的消化道肿瘤之一，其发病率及死亡率均较高1它的出现与生活环境、饮食习惯、遗传等因素息息相关；近些年，食道癌患病率呈现逐年上升的趋势，多发于40岁以上男性2食管癌的典型症状表现为进行性咽下困难，逐渐从硬到软甚至到唾液也难以下咽，食道癌的发生会对患者的正常进食及生活质量产生严重影响2-4食道癌中晚期患者难以根治，因此，早期诊断和早期有效治疗对于提升患者治愈率至关重要对于中晚期患者，即使结合手术和放化疗等方法，也会给患者带来很大的副作用，研究显示食道癌术后不良症状发生率很高5，但其病发机制仍不清楚4,6鬼针草（Bidens Pilosa L）作为一年生或多年生草本植物，茎直立，在我国各省均有分布，种类较多，为荒地杂草之一7作为中国民间常用草药，鬼针草最早记载于本草拾遗，性温，味苦，无毒，全草均可入药，有多种生物活性成分和广泛的药理作用8-12；药效化学发现鬼针草含有大量黄酮类11、酚酸类等成分，具有清热、解毒、散瘀、消肿等功效现代研究认为，鬼针草具有抑菌抗炎、抗干眼、抗衰老、抗病毒等作用；在降低患者血压、减轻靶器官的损害方面具有重要作用13；能够抑制肿瘤细胞增殖，对白细胞增殖具有体外抑制作用14；对急性黄疸型肝炎15等有一定的治疗 38作用本研究以食道癌细胞（KYSE150）为研究对象，研究鬼针草提取物对食道癌增殖、黏附、凋亡的影响，同时在分子层面上探讨鬼针草提取物对食道癌的药理机制有效推动中药鬼针草在预防和治疗食道癌中的运用，降低食道癌的发病率1材料试剂：芦丁（纯度98%）、金丝桃苷（纯度98%）、色谱级乙腈、色谱级甲醇、磷酸（AR）；DMEM培养基、全组分牛血清白蛋白、胰蛋白酶粉；TRNzol Universal Reagent、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、无酶无菌水；反转录试剂盒、PowerUpTM SYBRTM Green、噻唑兰（MTT）、纤连蛋白（FN）、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸钠、硝酸纤维素膜（NC膜）、ECL化学发光试剂（enhanced chemiluminescence）；引物（生工生物工程股份有限公司）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、一抗（-actin Mouse）、一抗（Bax Antibody）、二抗（Goatanti-Mouse IgG）、二抗（Goat anti-Rabbit IgG）仪器：高效液相色谱仪、Eclipse XDB色谱柱、电子天平、PH酸度计、恒温水浴锅、立式压力蒸汽灭菌锅、台式高效冷冻离心机、电热恒温鼓风干燥箱、倒置显微镜、医用超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、超微量核酸蛋白测定紫外可见光光度计、旋涡混合器、二维摇床、酶标仪、LightCycler96实时荧光定量PCR仪（罗氏）、电转印器、电泳仪、医用低速离心机2方法2.1鬼针草提取物的制备采摘新鲜的鬼针草，置于阳光下晒干称量100 g晒干的鬼针草，剪碎置于锅中，加入500 mL水，大火煮沸后中火熬煮2 h，捞出滤渣滤渣继续加300 mL水，大火煮沸后中火熬煮1 h，捞出滤渣合并两次滤液，再用过滤装置过滤掉残留的微小滤渣继续熬煮浓缩至接近稀稠状，量取滤液总量，计算得出鬼针草提取物的浓度2.2鬼针草提取物的分析将标准品用甲醇溶解并稀释至合适浓度，设置高效液相色谱仪相关参数，色谱柱：ZORBAXEclipse XDB-C18（Analytical 5 m 4.6250 mm）；流动相A：0.1%磷酸水溶液，流动相B：乙腈；进样量：10 L；流速：1.0 mL/min；吸光度：360 nm；柱温：30 根据表1的高效液相洗脱程序对液相色谱仪进行方法设置，重复实验通过绘制标准曲线，测定样品中芦丁和金丝桃苷的浓度，计算其在样品中所含含量2.3MTT法检测细胞活性将细胞状态良好的食道癌接种于10 mL培养皿（含血清和培养基）中，培养48 h，进行细胞传代，调整细胞浓度为1.2104个/mL在96孔板上标记好加药浓度、时间等信息，每孔接种200 L细胞液，静置培养 24 h计算及预混含有不同浓度鬼针草提取物（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的新鲜 DMEM，培养 24 h 后，在避光条件下配置 5 mg/mL 的 MTT，加入20 L/孔的MTT，培养4 h后，加入150 L/孔的DMSO在二维摇床上震荡15 min，用擦镜纸擦拭96孔板底部后，在酶标仪490 nm处检测OD值，利用软件作图得出细胞增殖的趋势2.4黏附性法检测细胞相互作用取1 mL的FN工作液（0.2 mg/mL）用9 mL的PBS溶解稀释，加入50 L/孔稀释后的FN工作液于96孔培养皿中，用锡纸包裹做避光处理，置于冰箱中4 培养24 h取1 g的BSA粉末加50 mL的PBS溶解，调节pH至7.4后，用0.22 m滤膜过滤除菌，加入100 L/孔封闭液封闭1 h每孔加入含 39有不同浓度鬼针草提取物和 DMEM 的混合液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL），培养 1.5h 后，在避光条件下配置 5 mg/mL 的MTT，加入20 L/孔的MTT，培养4 h后，加入150 L/孔的DMSO在二维摇 床 上 震 荡 15min，于 酶 标 仪490 nm处检测其吸光度，利用软件作图得出细胞的黏附趋势2.5实时荧光定量PCR检测细胞基因表达将细胞浓度调整为1.8105个/mL的细胞液接种于6孔培养皿中，培养24 h，分别加入含有不同浓度鬼针草提取物（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的DMEM的混合液，继续培养24 h用PBS清洗细胞两次后备用采用TRIzol法分离和提取总RNA，用赛默科技的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA在NCBI设计引物，得到所需信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成引物信息如表2所示，以-actin为内参，加入正向和反向引物，以及试剂盒中其他反应液，形成PCR反应体系，设置PCR反应程序，进行扩增，得到相关基因的表达量2.6蛋白免疫印迹法检测蛋白表达将细胞接种于 10 mL 培养皿中，细胞生长覆盖率为 70%时，用 PBS 清洗细胞后，分别加入含有不同浓度鬼针草提取物和 DMEM 的混合液（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），继续培养 24 h，用 PBS清洗细胞两次后备用使用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白；采用BCA法定量蛋白，按试剂盒操作，绘制蛋白标准曲线并测定蛋白浓度，确保等量的细胞进行电泳上样用SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统分离蛋白样品，浓缩胶80 V恒压电泳20 min，分离胶120 V恒压电泳110 min，然后电转至NC膜脱脂奶粉封闭60 min，4 孵育一抗16 h以上一抗浓度分别为Bax（1：2 500）、-actin（1：5 000）洗膜后加入二抗（1：10 000），4 孵育2 h，ECL化学发光显影进行FCQ拍摄，测定条带灰度值并计算蛋白相对表达量2.7数据分析该研究所得数据采用平均值标准差表示，运用Origin软件进行单因素方差统计学分析各组间数据比较分析采用Tukey检验*表示P0.05，为差异有统计学意义*表示P0.01，为差异有显著统计学意义3结果3.1鬼针草提取物的浓度测定100 g晒干的鬼针草，加水熬煮，重复两次，合并滤液继续浓缩至稀稠状，量取滤液，计算得到表1高效液相洗脱程序时间梯度/min011551515202025流动相A/%9075502020流动相B/%1025508080表2引物序列信息名称-actin-S-actin-ASBak-SBak-ASBax-SBax-ASFas-SFas-ASP53-SP53-AS序列（5 to 3）TGA CGT GGA CAT CCG CAA AGCTG GAA GGT GGA CAG CGA GGACG CTA TGA CTC AGA GTT CCCTT CGT ACC ACA AAC TGG CCGGC CCT TTT GCT TCA GGG TTAGC TGC CAC TCG GAA AAA GAACC CGG ACC CAG AAT ACC AAGAA GAC AAA GCC ACC CCA AGCCT CAC CAT CAT CAC ACT GGTCT GAG TCA GGC CCT TCT GT碱基数20202020202020202020 40鬼针草提取物物质含量为145.625 mg/mL3.2鬼针草提取物含量分析根据HPLC 检测结果，制得芦丁和金丝桃苷标准曲线，芦丁Y=15033X+43.683（R2=0.999 9）、金丝桃苷Y=205 66X+37.807（R2=0.999 5）利用标准曲线计算，可知在鬼针草提取物中，芦丁含量为0.996 mg/g、金丝桃苷含量为1.390 mg/g3.3鬼针草提取物对食道癌细胞增殖的影响如图1（抑制增殖*P0.05，*P0.01）可知鬼针草提取物对食道癌细胞的抑制作用整体上呈抑制作用加强的趋势药物浓度大于1 mg/mL时抑制作用明显，且其抑制效果具有显著的量效关系初步说明鬼针草提取物能抑制食道癌细胞的增殖活动图1鬼针草提取物对食道癌细胞增殖的抑制作用3.4鬼针草提取物对食道癌细胞黏附的影响细胞黏附分子使细胞-基质-细胞间发生黏附，以受体-配体结合的形式发挥作用，参与细胞的增殖与分化，是检验肿瘤转、移免疫应答等的必要手段如图2（抑制黏附*P0.05）所示，在药物浓度为1.4 mg/mL时，鬼针草提取物对食道癌细胞参与黏附的活动起显著的抑制作用，进一步表明鬼针草能抑制食道癌细胞间的信息交流与迁移图2鬼针草提取物对食道癌细胞黏附特性的抑制作用3.5鬼针草提取物对相关基因表达的影响鬼针草提取物对食道癌增殖具有抑制作用，可能与凋亡基因表达有关联结果如图3（促进基因表达*P0.05，*P0.01，*P0.001）所示，鬼针草提取物能刺激细胞凋亡基因 Bak、Bax、Fas、P53的mRNA表达量呈剂量依赖的上升趋势，其中对Bak和Bax的影响比后两者更加显著，说明鬼针