鸡ANP32家族蛋白亚细胞...在免疫器官中的表达特征分析_邢静如.pdf

11期3249收稿日期：2022-04-28基金项目：国家自然科学基金项目（31960698，31760732）；贵州省科学技术基金项目（黔科合基础 2020 1Y134）；贵州省地方家禽产业联合攻关项目（黔财农 2020 175号）通讯作者：段志强（1985-），https:/orcid.org/0000-0002-0033-3919，博士，副教授，主要从事家禽抗病育种与疫病防控研究工作，E-mail：第一作者：邢静如（1997-），https:/orcid.org/0000-0002-7532-2763，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：3471475801 鸡ANP32家族蛋白亚细胞定位及其在免疫器官中的表达特征分析邢静如，石海英，王燕碧，赵采芹，唐宏，段志强*（贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳550025）摘要：【目的】明确鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位及在不同月龄鸡免疫器官中的表达特征，为后续研究鸡ANP32家族蛋白与新城疫病毒（NDV）复制及其致病性的关系打下基础。【方法】分别构建鸡ANP32家族基因重组真核表达载体，转染HEK-293T细胞后进行诱导表达，利用Western blotting检测融合蛋白表达情况，并通过荧光观察分析融合蛋白亚细胞定位；同时采用实时荧光定量PCR检测ANP32家族基因在16月龄鸡免疫器官（脾脏、胸腺和法氏囊）中的表达水平。【结果】成功构建了鸡ANP32家族基因重组真核表达载体pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E，转染HEK-293T细胞后得到正确表达，获得携带EGFP标签的融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E，其分子量分别为60.0、57.9和56.9 kD。亚细胞定位分析结果表明，融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的荧光与细胞核荧光完全重合，即主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明，ANP32家族基因在16月龄鸡免疫器官（脾脏、胸腺和法氏囊）中均有表达，且在不同免疫器官中的表达水平存在差异；ANP32A和ANP32E基因在16月龄鸡免疫器官中呈先上升后下降的表达趋势，且在2月龄免疫器官中的相对表达量达峰值；ANP32B基因的表达则呈下降趋势，以1月龄鸡免疫器官中的相对表达量最高。【结论】鸡ANP32家族蛋白主要定位于细胞核，且ANP32家族基因在不同月龄鸡免疫器官中均有表达，但这3个基因具有独特的表达特征，其表达差异与免疫器官发育及免疫功能间的关系有待进一步探究。关键词：鸡；ANP32家族蛋白；亚细胞定位；免疫器官；组织表达特征中图分类号：S831.2文献标志码：A文章编号：2095-1191（2022）11-3249-08南方农业学报Journal of Southern Agriculture2022，53（11）：3249-3256ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.11.026Subcellular localization of chicken ANP32 family members andtheir expression characteristics in chicken immune organsXING Jing-ru，SHI Hai-ying，WANG Yan-bi，ZHAO Cai-qin，TANG Hong，DUAN Zhi-qiang*（College ofAnimal Sciences，Guizhou University/Key Laboratory ofAnimal Genetics，Breeding and Reproduction in thePlateau Mountains Region，Ministry of Education/Key Laboratory ofAnimal Genetics，Breeding andReproduction in Guizhou，Guiyang，Guizhou 550025，China）Abstract：【Objective】The aim of this study was to clarify the subcellular localization of chicken ANP32 family mem-ber proteins and their expression characteristics in immune organs of chicken at different months，which laid a foundationfor the follow-up study of the relationship between chicken ANP32 family member proteins and Newcastle disease virus（NDV）replication and pathogenicity.【Method】The recombinant eukaryotic expression vectors of chicken ANP32 familymember genes were constructed，induced their expression after transfection into HEK-293T cells.The expression and sub-cellular localization of the above fusion proteins was examined by Western blotting and fluorescence observation，respec-tively.At the same time，the expression levels of chicken ANP32 family member genes in immune organs（spleen，thymusand bursa of Fabricius）at 1-to 6-month-old chicken was detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）.53卷南 方 农 业 学 报 32500引言【研究意义】酸性亮氨酸磷酸核蛋白（Acidicleucine nuclear phosphoprotein 32，ANP32）是一类进化高度保守的酸性核磷蛋白家族，其成员包括ANP32A、ANP32B和ANP32E，一般含有220290个氨基酸，分子量约32 kD。ANP32家族蛋白成员间具有相似的结构特征，N端为富含亮氨酸的重复区域（Leucine-rich repeats，LRR），以LRR串联阵列的形式存在，为蛋白的相互作用提供了框架；C端为低复杂性的酸性区域（Low complexity acidic region，LCAR），约由100个氨基酸组成，其中天冬氨酸和谷氨酸占60%75%，由于LCAR结构缺乏疏水性氨基酸而影响三级结构的形成，致使该结构是以游离的形式存在，从而具有与带正电荷蛋白发生相互作用的能力（Matilla and Radrizzani，2005；de Chiara etal.，2008；Reilly et al.，2014）。ANP32家族蛋白具有多种生物学功能，如抑制蛋白磷酸化（Habrukowichet al.，2010）、染色体修饰和重构（Tochio et al.，2010；Obri et al.，2014）、细胞凋亡调控（Shen et al.，2010）和病毒复制（Long et al.，2016），以及细胞内物质转运（Fries et al.，2007）等。因此，开展鸡ANP32家族蛋白亚细胞定位及其在免疫器官中的表达特征分析，可为后续探讨鸡ANP32家族蛋白在相关病毒复制中的作用机理提供理论依据。【前人研究进展】ANP32A基因于1994年首次被克隆（Vaesen et al.，1994），随后研究人员基于氨基酸序列相似性、进化保守性和结构相似性定义了ANP32家族其他蛋白成员（Matilla and Radrizzani，2005）。ANP32家族蛋白具有磷酸酶活性，其中ANP32A能有效抑制蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A，PP2A）（Li et al.，1996），可与鞘氨醇相互作用以调节人类内皮细胞中的PP2A活性及环氧合酶-2（COX-2）表达，进而影响细胞内信号传导和炎症反应（Habrukowich et al.，2010）。此外，ANP32A能与突变的人类共济失调蛋白1（Ataxin-1）结合而调节PP2A活性（Snchez et al.，2013），ANP32E也可抑制PP2A活性（Costanzo et al.，2006），但ANP32B不具备此功能（Sun et al.，2006）。ANP32家族具有调节染色质结构并影响转录过程的功能，其中，ANP32A主要通过电荷作用与组蛋白H3的N末端结合而影响组蛋白H3修饰，进而抑制其乙酰化过程（Schneider et al.，2004）；ANP32B与Krppel样因子5（Krppel-like factor 5，KLF5）直接相互作用，且被KLF5招募至启动子区域，阻止组蛋白乙酰化，进而抑制转录过程（Munemasa et al.，2008）；ANP32E能解离由DNA和组蛋白变体H2A.Z（Histonevariant H2A.Z，H2A.Z）形成的非核小体聚集体，因此H2A.Z蛋白可结合在特定的DNA转录位点而调节转录过程（Mao et al.，2014）。ANP32家族蛋白还具有调节细胞内物质转运的功能，ANP32A和ANP32B作为mRNA结合蛋白HuR与核输出受体CRM1间的衔接成分，调节富含腺苷酸元素的mRNA转运（Bren-nan et al.，2000）。ANP32家族蛋白在病毒的复制中也发挥重要作用。研究发现，ANP32A和ANP32B蛋白是A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）复制及其聚合酶活性的决定性宿主因子，ANP32E蛋白不能支持IAV复制，但解析了IAV跨物种传播的分子机制（Zhang et al.，2019，2020）；ANP32家族蛋白也是B型【Result】The recombinant eukaryotic expression vectors（including pEGFP-C1-ANP32A，pEGFP-C1-ANP32B and pEG-FP-C1-ANP32E）of chicken ANP32 family member genes were successfully constructed and the fusion proteins withEGFP tags EGFP-ANP32A，EGFP-ANP32B and EGFP-ANP32E were obtained after transfection into HEK-293T cells.Their molecular weights were 60.0，57.9 and 56.9 kD respectively.The results of subcellular localization analysis showedthat the fluorescence of fusion proteins EGFP-ANP32A，EGFP-ANP32B and EGFP-ANP32E completely coincided withthe nuc