贺兰山东麓‘蛇龙珠’葡萄病...病种类鉴定及对采收期的影响_张强强.pdf

西 北 农 业 学 报 ，（）：贺兰山东麓 蛇龙珠 葡萄病毒病种类鉴定及对采收期的影响收稿日期：修回日期：基金项目：国家重点研发项目（）；宁夏回族自治区科技重大专项（）。第一作者：张强强，男，硕士研究生，从事资源利用与植物保护研究。：通信作者：顾沛雯，女，博士，教授，主要从事植物病理学、生物防治与菌物资源利用研究。：张强强，顾沛雯，张继丰（宁夏大学 农学院，银川 ；宁夏西鸽酒庄有限公司，宁夏青铜峡 ）摘要为摸清宁夏贺兰山东麓 蛇龙珠 葡萄感染病毒种类，探究葡萄病毒病对果实品质及其采收期的影响。以 蛇龙珠 葡萄为材料，通过 方法鉴定 蛇龙珠 葡萄感染病毒种类；利用主成分分析法（）对葡萄果实各理化指标进行综合评价，确定罹病和无症状对照组葡萄的最佳采收期。结果表明：蛇龙珠 葡萄感染种葡萄病毒，分别为 、和 ，复合侵染严重；与对照组相比，罹病葡萄的 值降低 ，净光合速率降低 ，叶片气孔导度降低 ，可溶性固形物降低 ，还原糖含量降低 ，糖酸比降低 ，滴定酸含量增加 ；通过主成分分析得到 年度对照组葡萄的最佳采收期为月 日，罹病葡萄的最佳采收期为月 日。综上，蛇龙珠 葡萄感染种葡萄病毒，病毒感染导致植株叶片光合作用下降，果实可溶性固形物、还原糖、单宁等物质积累降低，造成酿酒葡萄采收期推迟周。关键词 蛇龙珠 葡萄；病毒病；葡萄采收期；主成分分析 蛇龙珠 葡萄（）是 品丽珠 赤霞珠 等品种混合群体中，经过长期选育而成的一个酿酒葡萄品种。其酿造的葡萄酒常带有独特的草本气息，单宁质地柔软，入口顺滑，成为国内独具代表性的红色酿酒葡萄之一。该品种耐干旱，喜沙壤土质，在宁夏贺兰山东麓和甘肃河西走廊种植表现良好，是宁夏主栽的红色酿酒葡萄品种之一。但是随着宁夏葡萄种植面积的扩大，葡萄苗木引进和输出日益频繁，造成葡萄病毒病危害猖獗，研究发现贺兰山东麓主要葡萄病毒病为卷叶病和扇叶病，蛇龙珠 感染病毒率最高，为。葡萄病毒种类繁多，迄今为止，从世界各地的葡萄上分 离 的 病 毒 有 种，国 内 报 道 有 种，其中对卷叶伴随病毒（，）和葡萄扇叶病毒（，）研究最多。常用葡萄病毒的鉴定方法主要有指示植物鉴定法、酶联免疫吸附测定法、逆转录聚合酶链式反应（，）检测技术、分子杂交检测方法、逆转录环介导恒温扩增检测技术和小 测序技术，目前我国己报道的葡萄病毒多采用 方法确定。吕苗苗等利用种葡萄卷叶伴随病毒引物对宁夏贺兰山东麓 蛇龙珠 葡萄进行 检测，初步检出种卷叶病毒类型，其中 的检出率最高，为；刘万好等 通过小 测序鉴定出山东烟台地区叶片反卷的 蛇龙珠 携带有种已知病毒和种类病毒。蛇龙珠 葡萄复合侵染严重，但对感染病毒种类与症状类型的关系相关报道较少。葡萄感染病毒后，会对葡萄的产量、生理机能和品质产生重大影响。等 发现葡萄扇叶病可导致植株节间缩短，显著降低产量，症状 严 重 时，损 失 可 达 以 上。等 研究认为 品丽珠 感染 后，降低了每藤新梢数、新梢生长和木质化程度。韩爱芹等 发现，感染卷叶病后葡萄果实的葡萄糖和果糖的总量仅为对照组的 ，种花色苷单体含量显著降低，总量仅为对照组总量的 。目前有关葡萄病毒病的研究表明，病毒病会降低葡萄叶片中叶绿素含量及光合速率，减少总糖含量，提高酸度，。鉴于国内有关病毒病对 蛇龙珠 葡萄品质和采收期的影响的研究较少。本研究以贺兰山东麓树龄超过 的 蛇龙珠 葡萄为材料，利用 进行 种葡萄病毒的检测，明确 蛇龙珠 葡萄感染病毒的种类及造成危害的主要病毒，在此基础上，通过测定罹病和无症状对照组 蛇龙珠 葡萄的光合指标和果实理化指标，运用主成分分析法，评价不同采收时间对罹病和对照组 蛇龙珠 葡萄果实成熟度、葡萄品质及采收期的影响，以期为该产区葡萄无毒化种植提供依据，也为准确把握 蛇龙珠 葡萄最佳采收期提供理论参考。材料与方法材 料 年月于宁夏西鸽酒庄葡萄园中，从感染病毒病和外观正常的 蛇龙珠 葡萄树上采集叶片和果实，罹病葡萄选取标准：叶片反卷、发红，出现扇叶化症状；无症状对照组葡萄选取标准：葡萄植株正常，叶片无卷叶、发红、扇叶化症状，生长期保持绿色平整状态。方 法采样在 蛇龙珠 葡萄完成转色后（年月 日）进行采样，每次采样分别选取棵罹病和对照组葡萄树，每棵树按上、中、下部位随机采集穗葡萄和片葡萄叶，共采样次，采样日期分别为月 日、月 日、月日、月 日和月 日。以同一树体的片葡萄叶为个样品，用锡箔纸包好后迅速放入液氮罐中，罹病和对照组各 份样品，存于 冰箱备用，用于葡萄病毒检测；采集的葡萄果穗放入冰盒带回实验室，取一部分鲜样用层纱布挤汁待用，用于还原糖、滴定酸、和可溶性固形物的测定；将剩余样品经液氮迅速冷冻，使用研磨打样机（）将果实样品粉碎，冰箱贮存备用，用于总酚、单宁和花青素的测定。检测根据文献，设计 种葡萄病毒病的特异性引物，引物序列见表。将采集的葡萄叶片加入液氮迅速研磨至粉末状，取 至 的离心管中，按照 植物 提取试剂盒（美国 公司）使用说明书进行总 的提取。提取出的总 采用反转录试剂盒（北京全式金生物有限公司）说明书反转录成 ，采用设计的特异性引物对样品中病毒进行检测，每个样品重复次。扩增反应体系：，正向、反向引物各，酶，；扩增条件：，退火，退火温度见表，个循环，。用 琼脂糖凝胶电泳检测产物。产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测定项目及方法采用叶绿素计（型）测定 值；采用便携式光合仪（型，德国）测定净光合速率、蒸腾速率、叶片气孔导度、胞间二氧化碳浓度；采用斐林试剂滴定法（）测定还原糖；采用酸碱滴定法（）测定滴定酸（以酒石酸计）；采用 计（，上海）测定葡萄汁；采用手持糖度计（，上海）测定其可溶性固形物含量；采用 （福林丹尼斯）试剂显色法 测定单宁含量；采用 （福林酚）试剂显色法 测定总酚；采用 示差法 测定总花青素；采用称量法测定百粒质量，每个样品测定次。统计分析样本间差异采用 对数据进行整理，采用 邓肯氏多重比较进行显著性分析，采用 进行主成分分析及制图，得出主成分函数方程式，计算不同采收时期综合得分，确定最佳采收期。结果与分析 蛇龙珠 葡萄病毒病田间发病症状如图所示，蛇龙珠 葡萄植株感染病毒病后，绝大多数表现为卷叶症状。感染病毒初期，叶片轻微向后翻卷，叶脉黄绿色，叶片保持绿色（图）；之后叶片逐渐出现红色或紫红斑点（图）；随着叶片生长，红色斑点逐渐变大成为紫红色不规则肉斑（图），直至整个叶片变紫红，透过阳光看呈鲜红色，叶脉黄绿色，叶片反卷（图），后期葡萄中部和底部叶片反卷变红，变厚变脆（图）。在田间 蛇龙珠 葡萄感染病毒后期表现种症状，型：叶片反卷，叶缘锐呈不规则锯齿状，叶肉紫红色（图）；型：叶片发红，叶脉黄色，叶片反卷明显，叶脉间有黑色斑块（图）；型：期张强强等：贺兰山东麓 蛇龙珠 葡萄病毒病种类鉴定及对采收期的影响表用于 检测的 种葡萄病毒引物 病毒名称 病毒类型 引物 引物序列（）退火温度 扩增片段大小 葡萄卷叶伴随病毒 葡萄扇叶病毒 沙地葡萄茎痘病毒 葡萄病毒 葡萄病毒 葡萄病毒 葡萄斑点病毒 葡萄灰皮诺病毒 葡萄浆果内部坏死病毒 葡萄蚕豆萎蔫病毒 叶片未发生反卷，叶脉黄绿色，叶脉间有红色斑块（图）；型：叶片反卷，叶脉为黄绿色，正反看叶脉间都有紫黑色肉斑（图）。此外，前期在 蛇龙珠 叶片上还发现两种类似扇叶病症状，如图所示。一种为扇形叶或畸形叶：叶片皱缩畸形，叶缘缺刻深，缺口深达主脉，叶脉不对称、扭曲、明脉，叶缘锯齿锐呈不规则状，叶柄洼开角大，主脉聚近，呈扇叶状（图）。另一种为花叶形：叶片上分布有许多边缘不清、形状不规则的黄色斑点或斑块，颜色浓淡不同，呈环状线纹、褪绿环状圆或不规则形（图）。蛇龙珠 葡萄病毒种类鉴定利用 种病毒引物，对采集的罹病和对照组共 份田间样品进行 检测，并对扩增产物进行凝胶电泳和测序分析，结果如表和图所示，罹病样品均检测到病毒，共有种葡萄病毒，分 别 是 、和 ；对照组样品检测到 种病毒，分别是 、和 ，其中 的检出率最高，达 ，其次为 和 ，检出率分别为 和 ，的检出率最少，仅为 。西北农业学报 卷图 蛇龙珠 葡萄病毒病田间症状 扇形叶症状；花叶形症状 ；图 蛇龙珠 葡萄扇叶病类似症状 表 检测结果 病毒 参考序列 参考序列长度 样品测序长度 相似性 检出个数 罹病葡萄 对照组葡萄 检出率 （）（）（）（）（）（）（）（）期张强强等：贺兰山东麓 蛇龙珠 葡萄病毒病种类鉴定及对采收期的影响 ；图 产物琼脂糖凝胶电泳 针对上述 蛇龙珠 葡萄感染病毒后的种后期 症状类型（图）分别进行 检测发 现，型 症 状 检 测 到 、和 ；型症状检测到 、和 ；型症状检测到 、和 ；型症状检测到 、和 。说明 蛇龙珠 葡萄病毒病复合侵染严重，感染的病毒种类不同，其症状表现也不同。病毒感染对 蛇龙珠 葡萄光合指标的影响由表可知，与对照相比，罹病葡萄的叶片气孔导度和光合速率显著降低（），叶片气孔 导 度 降 幅 为 ，净 光 合 速 率 降 幅 为 ；罹病葡萄的 值极显著降低（），降幅为 。说明病毒感染导致葡萄光合作用减弱。表病毒感染的 蛇龙珠 葡萄光合指标 检测指标 罹病葡萄 对照组葡萄 降幅 蒸腾速率（）叶片气孔导度（）净光合速率（）胞间 浓度（）值 注：数据为平均数标准误。同行数据后不同的小写字母表示处理之间在 水平上存在显著差异，大写字母表示处理之间在 水平上存在显著差异。下同。：，病毒感染对 蛇龙珠 葡萄果实品质的影响如表所示，罹病葡萄果实各成分的累积动态与对照组葡萄基本一致，、可溶性固形物、还原糖、百粒质量、花青素、总酚、糖酸比、固酸比随果实成熟总体呈现增加趋势，可滴定酸和单宁随果实成熟总体呈现下降趋势。对比次采样测定结果，在月 日和月 日罹病葡萄果实各成分含量与对照相当。自月日第次采样一直到成熟采收，罹病葡萄果实各成分含量逐渐与对照形成差异，其中在月 日差异最大。与对照相比，罹病葡萄的可溶性固形物含量呈极显著下降（），在月 日降幅最大，为 ；罹病葡萄还原糖含量、糖酸比和固酸比在月 日与对照差别达到极显著水平（），降幅最明显，还原糖含量降幅为 ，糖酸比降幅为 ，固酸比降幅为 ；罹病葡萄的可滴定酸含量在月 日与对 照 相 比 呈 显 著 增 加（），增 幅 为 ；罹病葡萄的 和百粒质量在月 日采 样 测 定 结 果，与 对 照 相 比 显 著 降 低（），降低，百粒质量降低；罹病葡萄的花青素、总酚和单宁含量与对照相比有所降低，但无显著差异。蛇龙珠 葡萄适宜采收期的主成分分析针对罹病和对照组葡萄的 个果实品质指标批样品分别进行主成分分析，由表可知，按主成分提取特征值需大于的原则，罹病和对照组葡萄各提取个有效主成分，其累计方差贡献率分别为 和 ，具有一定的代表性，可进行进一步分析。西北农业学报 卷表 蛇龙珠 葡萄果实各理化指标检测结果 检测指标 日期 罹病葡萄 对照组葡萄 降幅 可溶性固形物 还原糖（）可滴定酸（）糖酸比 固酸比 百粒质量 花青素（）总酚（）单宁（）期张强强等：贺兰山东麓 蛇龙珠 葡萄病毒病种类鉴定及对采收期的影响表主成分方差分析 处理 主成分 特征值 方差贡献率 累计方差贡献率 罹病葡萄 对照组葡萄 如图主成分载荷图所示，罹病和对照组葡萄的 都与、可溶性固形物、还原糖、百粒质量、糖酸比、固酸比具有较好的相关性，解释了这个变量在确定最佳采收期时所起到的作用，且主要都是反映葡萄浆果本身品质的指标；与总酚、单宁具有较好的相关性，解释了这个变量在确定最佳采收期时所起到的作用，且主要都是反映葡萄浆果在酿造过程中较为重要的品质指标。罹病葡萄的载荷图；对照组葡萄的载荷图 ；图主成分载荷图 根据主成分分析得到的成分矩阵，计算特征向量矩阵，将所提取出的主成分分别表示为各变量的线性组合，得到主成分的函数方程式（）（）。方程式（）和方程式（）为罹病葡萄两个主成分的函数方程，方程式（）和方程式（）为对照组葡萄两个主成分的函数方程。方程式中 分别代表、可溶性固形物、还原糖、可滴定酸、百 粒 质 量、花 青 素、总 酚、单 宁、糖 酸 比、固酸比。.（）.（）.（）.（）.（）.（）对所有变量进行标