海藻玉壶汤加减海藻甘草反药...kt通路相关基因表达的影响_王鑫.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 800 海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠PI3K/Akt通路相关基因表达的影响王鑫1,2，葛超冉1，钟赣生1，霍敏1，贺佳1，李娜1，陈丰1，柳海艳1，修琳琳1，陈绍红1，许皖1，范盎然1（1北京中医药大学，北京 100029；2齐河县卫生健康局，德州 251100）摘要：目的：探讨海藻、生甘草剂量为2015年版中华人民共和国药典规定高限剂量的2倍条件下，海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠PI3K/Akt通路相关基因表达的影响。方法：84只大鼠按体质量分为空白组、模型组、阳性药组、全方组、去海藻组、去甘草组、去藻草组，每组12只。用丙硫氧嘧啶复制甲状腺肿大动物模型，然后给予相应药液灌胃治疗。采用TUNEL检测细胞凋亡，计算凋亡指数，采用实时定量PCR和Western Blot检测PI3K、Akt、Cyclin D1、Bcl-2 mRNA和Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果：与模型组比较，全方组凋亡指数显著升高（P0.05），各中药给药组PI3K、Cyclin D1和Bcl-2 mRNA表达水平显著降低（P0.01，P0.05），全方组和去藻草组Akt mRNA表达显著降低（P0.05），各中药给药组p-Akt、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低（P0.01，P0.05）。结论：海藻玉壶汤加减海藻甘草对丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠有显著治疗作用，通过作用于PI3K/Akt信号通路，下调Cyclin D1和Bcl-2等mRNA的表达，对细胞增殖和细胞凋亡两方面进行调控，起到治疗甲状腺肿大的作用。关键词：海藻玉壶汤；甲状腺肿大；TUNEL凋亡检测；PI3K/Akt信号通路；mRNA；海藻甘草反药组合；动物模型基金资助：国家重点基础研究发展计划（“973”计划）（No.2011CB505306），北京中医药大学校级科研纵向发展基金项目（No.2019-ZXFZJJ-066）Effects of modified Haizao-Gancao anti-drug combination of Haizao Yuhu Decoction on PI3K/Akt pathway-related genes expression in goiter ratsWANG Xin1,2,GE Chao-ran1,ZHONG Gan-sheng1,HUO Min1,HE Jia1,LI Na1,CHEN Feng1,LIU Hai-yan1,XIU Lin-lin1,CHEN Shao-hong1,XU Wan1,FAN Ang-ran1(1Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2Health Bureau of the Qihe,Dezhou 251100,China)Abstract:Objective:To explore the effect of modified Haizao-Gancao anti-drug combination of Haizao Yuhu Decoction(HYD)on the expression of genes related to PI3K/Akt pathway in goiter rats under the condition that the dosage of Haizao and Gancao is twice the high limit dosage prescribed in the Pharmacopoeia of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China 2015 Edition.Methods:A total of 84 rats were randomly divided into:blank group,model group,positive drug euthyrox group,HYD group,HYD without Haizao group,HYD without Gancao group and HYD without Haizao and Gancao group,12 rats in each group.The propylthiouracil(PTU)was used to establish the model of goitre,then,each group were given the corresponding oral liquid.Apoptosis was detected by TUNEL method,apoptosis index was calculated,and expression of PI3K,Akt,Cyclin D1 and Bcl-2 mRNA were detected by real-time quantitative PCR,the protein expression of Akt,p-Akt were detected by Western Blot.Results:Compared with the model group,the apoptosis index of the HYD group was distinctly rised(P0.05),the mRNA expression level of PI3K,Cyclin D1 and Bcl-2 showed varying degrees of decline in the groups which were given interventional medicine(P0.01,P0.05),the expression of AKT mRNA was significantly decreased in the HYD group and HYD without Haizao and Gancao group(P0.05),the expression of p-Akt,p-Akt/Akt protein was significantly decreased in the groups which 研究报告通信作者：钟赣生，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学，邮编：100029，电话：010-64287006，E-mail：内文2.indd 8002023/2/28 10:35:58中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 801 中药“十八反”形成于宋代，于金元时期形成广为传诵的“十八反”歌诀1，被后世奉为中药配伍禁忌的重要内容。海藻和甘草这一药对属于中药“十八反”反药组合之一，且为“十八反”歌诀中唯一一组两药单用均无毒的反药组合。海藻玉壶汤尤其擅长治疗瘿瘤之气滞痰凝证，是海藻与甘草同用的代表方，外科正宗云：“治瘿瘤初起，或肿或硬，或赤或不赤，但未破者”2。临床常用其治疗甲状腺肿大（以下简称甲肿）、甲状腺腺瘤等疾病，疗效显著3-4。本课题组前期针对含有海藻甘草这一反药组合的海藻玉壶汤对甲肿模型大鼠的药效、毒性进行一系列的实验探究，结果表明，海藻和甘草的剂量为2015年版 中华人民共和国药典（以下简称药典）规定高限的2倍（海藻24 g，生甘草20 g）时效果最好，且海蒿子效果优于羊栖菜5。根据张晨等6研究结果，海藻玉壶汤通过作用于Bax/Bcl-2这一组基因，促进甲状腺细胞凋亡，从而起到治疗甲肿的作用。PI3K/Akt信号是这一对凋亡调节基因的上游信号，多项研究表明该通路能够通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡起到抗甲肿的作用7-8，且葛超冉等9 研究结果表明，海藻玉壶汤能够通过抑制其下游通路mTOR-p70S6K/4E-BP1而抑制细胞增殖，从而起到抗甲肿的作用。本研究基于前期研究成果，选取“效”最明显的组合，即海藻和生甘草剂量均为药典规定高限剂量的2倍，从基因表达角度探究此剂量下海藻玉壶汤加减海藻甘草反药对甲肿模型大鼠PI3K/Akt通路相关基因表达的影响，进一步明确和完善其治疗机制。材料1.动物 SPF级雄性Wistar大鼠84只，6周龄，体质量180220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0006。屏障环境饲养，许可证号：SYXK（京）2016-00038，室内温度（222），相对湿度50%70%。本研究已经通过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查批准（审查批号：BUCM-4-2019070505-3029）。2.药物 生甘草（内蒙古产，批号：1901025）、海藻（福建产，批号：1904028）、法半夏（四川产，批号：D190511001）、浙贝母（浙江产，批号：1802404）、连翘（山西产，批号：1905008）、川芎（四川产，批号：1904005）、独活（四川产，批号：1903009）、昆布（福建产，批号：1812407）、醋青皮（四川产，批号：1812403）、陈皮（四川产，批号：1901071）、当归（甘肃产，批号：1905012），以上药物均购自北京双桥燕京中药饮片厂，经鉴定均为合格中药饮片。丙硫氧嘧啶片（批号：H31021082，规格：50 mg，上海朝晖药业有限公司），使用时配制成1 g/L溶液；左甲状腺素钠片（商品名：优甲乐，规格：50 g，批号：H20140052，Merck KGaA公司），使用时配制成2 mg/L溶液。3.试剂 无菌无酶水（E476-100ML，VWR Life Science Biotechnology），Hipure Total RNA Mini Kit（货号：R4111-02，MAGEN生物），Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit（货号：K1622，Thermo），PCR荧光染料mix（货号：4367659，Invitrogen），Akt（货号：4685S，CST），p-AKT（货号：66444-1-Ig，proteintech），-actin（货号：20536-1-AP，proteintech），以上试剂均购自北京百诺威生物科技有限公司。4.仪器 超净台（型号：YT-CJ-2D/B，北京亚太科隆仪器技术有限公司），混合型碾磨仪（型号：MM400，德国RETSCH），旋涡混合器（型号：VORTEX-5，Kylin-Bell），离心机（型号：Centrifuge5424R，德国Eppendorf），PCR扩增仪（型号：AG 22331 Hamburg，德国Eppendorf），实时荧光定量PCR系统（型号：CFX96 optics Module，美国Bio-Rad公司）。方法1.药液制备 海藻玉壶汤药物组成：生甘草24 g，海藻 20 g，昆布18 g，法半夏、浙贝母、连翘、川芎、独活、醋青皮、陈皮、当归各9 g，除生甘草、海藻，其他药物剂量皆延续本课题组前期实验剂量5-6。根据大鼠与成人（体重70 kg）用药剂量的换算系数0.018计算饮片剂量，称取药物，第1次用10倍量水浸泡 2 h，煮沸后再煎1 h，滤过；第2次用8倍量水，煮沸后煎煮1 h，滤过，将2次药液充分混匀，用水浴锅加热，最后得到浓缩液，冷却后放入冰箱保存。2.分组与模型复制 按照大鼠体质量将其随机分为空白组、模型组、阳性药组（优甲乐）、海藻玉壶汤全方组（以下简称全方组）、海藻玉壶汤全方去海藻组（以下简称去海藻组）、海藻玉壶汤全方去生甘草组（以下简称去甘草组）、海藻玉壶汤全方去海藻生甘草组（以下简称去藻草组），每组12只。适应性喂养3 d后，空白组给予去离子水，其余6组大鼠用丙硫氧嘧啶1 mg/100 g进行灌胃，连续14 d。经血