桂枝附子汤对TNF-α诱导...样滑膜细胞增殖及分泌的影响_石颖.pdf

8 陈雪梅,刘寨华,佟琳,等.基于中医古籍妇人经期养生思想探析 J.中国中医基础医学杂志,2019,25(5):578-579,589.9 王肯堂.女科证治准绳 M.太原:山西科学技术出版社,2012.10 陈自明.校注妇人良方 M.许润三,注释.南昌:江西人民出版社,1983.(收稿日期 2022-05-25)实验研究 基金项目:2019 年重庆市科卫联合中医药项目(2019ZY3480):桂枝附子汤对 RA 患者成纤维滑膜样细胞增殖及相关因子表达的影响研究,负责人:夏平;2018 年重庆市卫健委中医药项目(ZY2018200)4:洪多伦教授中西医结合寒热辨证治疗类风湿关节炎的经验,负责人:石颖。通讯作者:夏平,硕士,中医主治医师,研究方向:中西医结合防治风湿疾病,E-mail:446583046 ;第一作者:石颖,本科,副主任中医师,研究方向:中医药防治风湿病。桂枝附子汤对 TNF-诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖及分泌的影响石颖1,彭薪颖2,杨洪2,彭雪莲3,夏平2,(1.重庆市第九人民医院中西医结合科,重庆 402360;2.重庆医科大学附属大足医院中医科,重庆 402360;3.重庆医科大学附属大足医院检验科,重庆 402360)摘要:目的:探讨桂枝附子汤(Guizhi Fuzi Decoction,GFD)对 TNF-(Tumor necrosis factor alfa,TNF-)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Human Fibroblast-Like Synoviocytes:Rheumatoid Arthritis,HFLS-RA)增殖及分泌的影响及机制。方法:分组为:空白组对照;TNF-组;甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组;桂枝附子汤高、中、低剂量组。用 TNF-(10 ng/ml)?刺激 HFLS-RA 细胞,并加入不同浓度的桂枝附子汤(200ug/ml、400ug/ml、800ug/ml)作用后,采用 CCK-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力;ELISA(enzyme linked immu-nosorbent assay,ELISA)及 qPCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测 MMP3(Matrix metalloproteinases 3,MMP3)、IL-1(Interleukin-1,IL-1)、IL-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-8(Interleukin-8,IL-8)及 RANKL(Receptor Activator of Nuclear Factor-B Ligand,RANKL)的分泌及表达水平。结果:与空白对照组相比,TNF-显著增强 HFLS-RA 细胞的增殖及细胞因子分泌(P0.001);与 TNF-组比较,桂枝附子汤高、中、低剂量组均显著抑制 HFLS-RA 细胞的增殖及细胞因子分泌(P0.001);与甲氨蝶呤(MTX)阳性药物对照组相比,桂枝附子汤各剂量组抑制细胞增殖效率不及 MTX 组,但 GFD 中、高剂量组可显著抑制 IL-1、IL-6、IL-8 及 RANKL 等细胞因子的分泌(P0.001)。结论:桂枝附子汤可显著抑制 TNF-诱导的 HFLS-RA 细胞的增殖及其细胞因子的分泌,其机制可能与 JAK/STAT 信号通路相关。关键词:桂枝附子汤;细胞因子;类风湿关节炎;成纤维样滑膜细胞 中图分类号:R 285.5 文献标志码:A 文章编号:1000-3649(2023)02-0057-06 Effect and Mechanism of Guizhi Fuzi Decoction on TNF-Induced Proliferation and Secretion for Human Rheu-matoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes/SHI Ying1,PENG Xinying2,YANG Hong2,et al./1.Department of Tradi-tional Chinese Medicine and Rheumatology,Chongqing Dazu District Peoples Hospital(Chongqing 402360,China);2.Laborato-ry of Dazu Hospital Attached to Chongqing Medical University(Chongqing 402360,China)Abstract:Objective:To investigate the effect and mechanism of Guizhi Fuzi Decoction(GFD)on TNF-induced prolifer-ation and secretion for human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes(HFLS-RA).Methods:The groups were:blankcontrolled group,TNF-group,MTX group,and high,medium,and low dose groups of Guizhi Fuzi Decoction.After stimula-ting HFLS-RA cells with TNF-(10 ng/ml),and adding different concentrations of Guizhi Fuzi Decoction(200 g/ml,400g/ml,and 800 g/ml),cell proliferation was detected by CCK-8;the secretion and expression levels of MMP3,IL-1,IL-6,IL-8,and RANKL were detected by ELISA and qPCR.Results:TNF-significantly enhanced the proliferation and cytokinesecretion of HFLS-RA cells compared with the blank controlled group(P0.001).Compared with the TNF-group,the high,752023 年第 41 卷第 2 期Vol.41,No.2,2023四 川 中 医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicinemedium,and low dose groups of GFD significantly inhibited the proliferation and cytokine secretion of HFLS-RA cells(P0.001).Compared with the methotrexate(MTX)group,the inhibition of cell proliferation was less efficient in each dose group ofGFD than in the MTX group.However,the secretion of cytokines such as IL-1,IL-6,IL-8,and RANKL was significantly in-hibited in the middle and high dose groups of GFD(P0.001).Conclusion:Guizhi Fuzi Decoction significantly inhibits TNF-induced proliferation of HFLS-RA cells and their cytokine secretion by a mechanism that may be related to the JAK/STAT signa-ling pathway.Keywords:Guizhi Fuzi Decoction;Rheumatoid arthritis;Fibroblast-like synoviocytes;Cytokines类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种免疫介导的滑膜疾病,滑膜炎性增生导致软骨损伤和骨质侵蚀,进而表现为慢性和进行性关节疼痛、关节破坏、畸形和残疾1-3。成纤维样滑膜细胞(Fi-broblast-like synoviocyte,FLS)是滑膜炎性增生的首要效应细胞,软骨和非骨质支持结构的破坏在很大程度上归因于 FLS 的作用4。在 RA 中,FLS 有类似于肿瘤的增殖、迁移和侵袭等攻击性的生物学特性。TNF-(tumor necrosis factor-,TNF-),由活化的单核巨噬细胞产生,对大多数肿瘤细胞表现为促凋亡作用,而在 RA 中的 FLS 上,表现为促增殖和促进分泌多种致病介质的作用,如分泌细胞炎症因子和蛋白酶,以增强 FLS 效应能力5-6。因此,研究如何抑制类风湿关节炎中 TNF-诱导的 FLS 的异常增殖及分泌,有助于控制滑膜炎症增生、肥厚,防止骨组织和软骨的进一步侵蚀,延缓甚至纠正 RA 病况。RA 归属于中医学“痹证”范畴。其病机关键为“阳虚邪凑”,发病多由素体虚弱以致正气不足、营卫不和,风、寒、湿等乘虚侵袭机体。营卫不和贯通痹证发病的全过程,治当营卫同调,祛邪通络7。桂枝附子汤,出自张仲景 伤寒杂病论,方中生姜与桂枝配伍,调和营卫,振奋阳气,散风、寒、湿邪通络。现代医学对 RA 的治疗处于瓶颈期,即便使用生物制剂依然有将近 40%的患者存在关节炎症反应8。而中医药药理研究发现,桂子附子汤可降低胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠血清中 IL-6、IL-1 的表达水平,具有显著的抑制炎症细胞因子生成作用9-10。基于此,聚焦滑膜炎症,发挥中医药抗炎、抗病优势,对 RA 的长效管理具有重要意义。本研究针对 RA 的中心致病环节滑膜细胞炎性增生及炎症因子分泌,采用人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞经 TNF-体外诱导培养细胞模型,结合传统医学的治法治则,分析观察桂枝附子汤对 FLS 增殖和分泌的影响,并阐述其可能的机制,以期为 RA 的治疗提供新思路。1材料1.1细胞及试剂HFLS-RA 细胞购买自上海细胞库;桂枝附子汤由桂枝 24g、制附子 30g、生姜 18g、大枣 24g 及炙甘草 12g 组成(免煎颗粒剂型,均取自重庆市大足区人民医院中药免煎颗粒药房广州一方制药有限公司提供);DMEM:Gibco,1210046;FBS:PAA Laboratories,A15-101;Trizol 试剂:In-vitrogen,10296028;PrimeScriptRTreagentKit:TakaraBiotechnology,RR047A;SYBRPremixExTaq:Takara Biotechnology,RR420L;氯仿:国药集团化学试剂有限公司,10006818;无水乙醇:国药,80059461;白细胞介素 1(IL-1)ELISA 试剂盒:酶联生物,ml058059;白细胞介素 6(IL-6)ELISA试剂盒:酶联生物,ml058097;白细胞介素 8(IL-8)ELISA 试剂盒:酶联生物,ml028580;基质金属蛋白酶 3(MMP-3)ELISA 试 剂 盒:酶 联 生 物,ml026254。1.2仪器二氧化碳培养箱:日本松下,MCO-18AC;酶标仪:Bio-Tek,ELX800;制冰机:先欧科技有限公司,XOXB-20;光学显微镜:奥林巴斯,CKX53;超净工作台:BIOBASE,BBS-DDC;荧光定量 PCR 仪器:赛默飞,Q3;水浴锅: