黄曲霉ste20-like...与ste20基因功能的比较_马龙雪.pdf

农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022，41（12）:2660-26712022年12月马龙雪，李旭，邢福国.黄曲霉ste20-like基因功能鉴定及与ste20基因功能的比较J.农业环境科学学报,2022,41（12）：2660-2671.MA L X,LI X,XING F G.Identification of ste20-like and comparison with the function of ste20 in Aspergillus flavusJ.Journal of Agro-Environment Science,2022,41（12）：2660-2671.开放科学OSID黄曲霉ste20-like基因功能鉴定及与ste20基因功能的比较马龙雪，李旭，邢福国*（农业农村部农产品质量安全收贮运管控重点实验室/中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）Identification of ste20-like and comparison with the function of ste20 in Aspergillus flavusMA Longxue,LI Xu,XING Fuguo*（Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-products Quality and SafetyControl in Storage and Transport Process,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100193,China）Abstract：The function of ste20-like in the growth,conidia formation,nucleus formation,and invasiveness was examined,and thedifferences in these functions with those of ste20 in Aspergillus flavus were determined.Aspergillus flavus NRRL3357 was used in this study.The two genes were compared to identify their similarities and subjected to bioinformatics analysis using NCBI.The target genes were收稿日期：2022-11-03录用日期：2022-11-28作者简介：马龙雪（1994），男，山东济南人，博士研究生，从事微生物分子生物学与基因工程研究。E-mail：*通信作者：邢福国E-mail：基金项目：国家自然科学基金项目（31972179）；青岛市科技惠民示范引导专项（21-1-4-ny-4-nsh）Project supported：The National Natural Science Foundation of China（31972179）；Qingdao City Science and Technology for the People Special Project（21-1-4-ny-4-nsh）摘要：为了鉴定ste20-like基因在黄曲霉生长、分生孢子形成、菌核形成中的作用以及其侵染性，并比较其与ste20基因功能的差异，以A.flavus NRRL3357为研究对象，对两个基因进行相似度比对和生物信息学分析，根据同源重组策略获得单基因缺失菌株ste20、ste20-like和双基因缺失菌株double（ste20-like&ste20），并分析基因敲除对菌株生长、分生孢子形成、菌核形成、黄曲霉毒素B1（AFB1）生物合成和侵染功能的影响。应用 pyrG 的双向遗传筛选成功获得 ste20、ste20-like和double；与野生型相比，单基因缺失和双基因缺失突变株的生长速率、分生孢子量、菌核数量以及侵染能力都显著降低，在毒素合成方面，ste20、ste20-like 和 double 菌株分别降低约 76%、93%和72%；突变株之间比较发现，ste20-like缺失对生长速率的影响大于ste20基因；突变株之间的分生孢子产生量无显著差异；ste20无菌核产生而ste20-like还有少量菌核产生；ste20-like菌株产生的毒素显著低于ste20和double菌株。ste20-like基因正调控黄曲霉生长、分生孢子生成、菌核形成、AFB1生物合成，并影响黄曲霉分生孢子对粮油种子的侵染能力。与ste20基因功能相比，ste20-like基因在调控黄曲霉生长、毒素合成方面对菌株的影响方面较显著，而在菌核形成方面ste20的基因调控作用更显著。关键词：黄曲霉；黄曲霉毒素B1（AFB1）；ste20-like；ste20；基因功能中图分类号：TS201.3；Q933文献标志码：A文章编号：1672-2043（2022）12-2660-12doi:10.11654/jaes.2022-1110马龙雪，等：黄曲霉ste20-like基因功能鉴定及与ste20基因功能的比较2022年12月黄曲霉（Aspergillus flavus）是常见的腐生真菌，广泛侵染食用农产品、食物和饲料，常见的被侵染并造成污染的有花生、玉米、棉籽等。黄曲霉次级代谢产生的黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是高毒性、高致癌性化合物，毒素污染不仅会严重损害粮食作物及制品的品质与食用和营养价值，对农产品的进出口贸易造成严重的经济损失，还会严重危害人和动物的健康1-3。20102019年10年间，欧盟食品和饲料快速预警系统（RASFF）对华通报真菌毒素污染634起，占食品通报总数的24.58%，在所有食品危害类型中高居第一位。其中AFs超标占绝大多数，共601起，占真菌毒素违例通报量的94.79%4。因此，开展AFs合成调控研究，为精准防控技术研发提供靶点具有十分重要的意义。MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）信号通路是保守的磷酸化传递通路，可调控细胞环境应激和信号传导，磷酸化传递等功能对于细胞生长发育极为重要，已有研究表明，在酵母中Ste20参与MAPK信号通路激活MAPKKK级联反应，能够参与调控Hog1渗透压调控通路和 Fus3信息素调控路径5-6。Ste20是在酵母、霉菌以及动物细胞中相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶7-10，在信号传导、蛋白磷酸化及应激反应等过程中非常重要，参与细胞周期中的多种过程10。ste20基因缺失会对细胞造成严重的影响，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中ste20p基因缺失导致菌株无有性生殖过程，出现不正常的菌落外观和出芽 状 态 等 表 型11。在 担 子 菌 酵 母（Basidiomyceteyeast）和 新 型 隐 球 菌（Cryptococcus neoformans）中，Ste20同源蛋白缺失导致有性生殖菌丝减少12。在光滑念珠菌（Candida glabrata）中Ste20同源蛋白缺失对菌丝结构无影响，但对渗透压条件更加敏感，菌株毒性降低13。在新生隐球菌（Cryptococcosis neoformans）中，Ste20同源蛋白缺失导致菌丝有性生殖能力缺失，毒性降低14-16。在A.flavus CA14菌株中，ste20基因缺失导致菌株生长、分生孢子形成、菌核形成、毒素生物合成量以及侵染能力都显著降低17。Ste20-like蛋白是与Ste20相似的蛋白，是指与酵母中Ste20蛋白催化结构域具有高度同源性的相似蛋白，因具有响应细胞分裂、生长和致病能力等多种功能而被广泛关注和研究，该类蛋白被归为Ste20-like家族蛋白18。Ste20蛋白一般包含C端PAKs（p21 activated kinases）和N端中间位置的GCKs（Germinal centre kinases）两个结构域。PAKs 结合结构域（PAKsbinding domain，PBD）与 Cdc42p-/Rho 样小 GTP 酶结合的结构域也被称为 Cdc42/Rac 互动结合结构域（CRIB），人类 PAK1和酵母 Ste20p蛋白的 CRIB结构域可与激酶结合并进行调节，CRIB结构域的缺失或被破坏会造成激酶失活19-20。Ste20-like蛋白具有与Ste20蛋白高度同源的催化结构域，仅在结构域的位置上与Ste20蛋白有所差异。Ste20蛋白的PAKs结构域在N端，而Ste20-like蛋白的PAKs结构域在蛋白序列的 C 端21。Ste20-like 的功能也非常重要，在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中Ste20-like蛋白Pak1/Shk1缺失导致细胞分裂异常，无有性生殖过程以及肌球蛋白磷酸化缺失等22-23，而 Ste20-like蛋白Pak2/Shk2缺失对菌丝无显著影响24；酿酒酵母中Ste20-like蛋白Cla4p缺失导致细胞分裂异常，菌丝侵染能力降低25。白色念珠菌中Cla4蛋白缺失导致细胞分裂异常，菌丝形态异常，侵染和毒力降低26；解脂耶氏酵母（Yarrowia.lipolytica）、黑粉菌（Ustilago maydis）、麦角菌（Clavieps purpurea）等中的Cla4蛋白缺失虽然对菌体功能的影响并不完全相同，但是对菌株的侵染力和毒性都有影响27。此外，在动物细胞中Ste20-like蛋白 Msts（Mst1、Mst2、Mst3、Mst4、Mst5）对细胞发育非常重要，参与调控磷酸化的级联反应、disrupted using homologous recombination.The ste20,ste20-like,and double-gene deletion strain（double）were constructed toexamine the effects of gene deletion on the fungal phenotype,sporulation,sclerotia formation,and aflatoxin production.Compared with thewild-type,the growth rate,conidial number,sclerotia number,and pathogenicity were significantly reduced in ste20,ste20-like,and thedouble strains,showing approximately 76%,93%,and 72%reductions in aflatoxin B1（AFB1）synthesis,respectively.Comparison of themutant strains revealed that ste20-like deletion more significantly decreased the growth rate compared to that in ste20.Conidia andsclerotia production did not significantly differ between the mutant strains.No sclerotia were detected in the ste20 strain,whereas very fewsclerotia were observed in the ste20-like strain.AFB1p