活性氧在红缘拟层孔菌杀伤白血病细胞中的作用研究_成晓霞.pdf

西北大学学报（自然科学版）年 月，第 卷第 期，（）收稿日期：基金项目：陕西省自然科学基金（，）；西安市专项科研计划项目（）第一作者：成晓霞，女，新疆吐鲁番人，副教授，从事天然产物药理活性开发等研究。通信作者：成瀛，男，陕西西安人，教授，从事血液肿瘤的发病机制研究，。中药学活性氧在红缘拟层孔菌杀伤白血病细胞中的作用研究成晓霞，王子见，何凤琴，成 瀛（西安文理学院 生物与环境工程学院 西安市秦岭天然产物开发与抗癌类创新药物研究重点实验室 西安文理学院基因工程实验室，陕西 西安；西安交通大学 生命科学与技术学院，陕西 西安）摘要 红缘拟层孔菌抗肿瘤作用受到广泛关注，但其弱极性化合物对白血病细胞的增殖抑制及作用机制尚缺乏实验证据。采用 法评价红缘拟层孔菌不同极性组分抗肿瘤活性，结果显示氯仿组分（）可显著抑制 细胞的增殖；进而结合流式细胞术分析 杀伤白血病细胞的作用机制，发现其能够显著提升胞内活性氧含量，同时伴随细胞质膜电位下降、胞内钙离子浓度上升、线粒体膜电位崩解、细胞凋亡率增加，而活性氧抑制剂则能明显缓解细胞凋亡的发生，提高细胞存活率。因此，可能调控活性氧的过量生成促进 细胞的死亡。关键词 红缘拟层孔菌；人急性单核白血病 细胞；活性氧；细胞凋亡中图分类号：；：（）（），（，；，）（）（），（），（）；红缘拟层孔菌 （）属担子菌纲、非褶菌目、多孔菌科、拟层孔菌属，又名红缘层孔菌、红缘多孔菌、松生拟层孔菌、红缘树舌、红带菌等，为北半球针叶林区广泛分布的木腐真菌，多见于我国长白山及秦岭地区。中国药用真菌记载，红缘拟层孔菌味微苦、性平、无毒，能祛风除湿、解热、强心、补肺益肾、和胃健脾、安神定志、扶正培本。自 年至今，国内外学者研究表明，红缘拟层孔菌含有多糖、萜类、脑苷脂类、油酸、亚油酸、棕榈酸等成分，且有抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等功效。近年来，有学者陆续报道红缘拟层孔菌的弱极性化合物也表现出抗肿瘤、抗氧化、抗炎、解热、镇痛等生理活性，但具体作用机制研究尚不充分。因此，本研究以体外培养的白血病细胞为模型，评价红缘拟层孔菌各极性组分的抗肿瘤活性，进而分析活性组分对人急性单核白血病 细 胞 内 活 性 氧（，）、线粒体膜电位、细胞质膜电位、浓度和细胞凋亡率的影响，探讨 造成的膜损伤在红缘拟层孔菌杀伤 细胞中的作用，以期为菌物药的研究与开发利用积累资料。材料与方法.材料 细胞株人慢性髓系白血病 细胞、人急性单核白血病 细胞由中国北京协和医科大学引进，将其培养于含 （体积分数）胎牛血清的 培养基中；小鼠白血病 细胞、人胚肾上皮 细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心引进，将其培养于含（体积分数）胎牛血清的 培养基中；以上细胞均在 （体积分数）、饱和湿度的培养箱中常规培养，使用对数生长期细胞进行实验。.药物及制备红缘拟层孔菌子实体采自陕西秦岭平河梁，海拔 ，。经陕西师范大学肖娅萍教授鉴定为红缘拟层孔菌 （），标本存于西安文理学院标本馆（）。将红缘拟层孔菌子实体清洗、烘干、粉碎，称取 粉末，加入 倍体积的 乙醇超声提取，滤液减压浓缩得浸膏.（得率.），用蒸馏水混悬后依次用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到红缘拟层孔菌氯仿组分（）、乙酸乙酯组分（）、正丁 醇 组 分（），分 别 相 当 于 生 药 量 的.、.、.。在生物安全柜中用 配制浓度为 的储存液，由基础培养基稀释为工作液。.主要试剂胎牛血清（公司）；、无菌、谷氨酰胺、胰酶、双抗（公司）；、罗 丹 明、（公司）；细胞凋亡试剂盒（公司）；其他试剂均为国产分析纯。.主要仪器超纯水仪、培养箱（公司）；生物安全柜（公司）；酶标仪（公司）；流式细胞仪（公司）；高速冷冻离心机（公司）；超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）。.方法.法检测细胞存活率取对数生长期 细胞、细胞、细胞、细胞，分别制成单细胞悬液，以 个 孔接种于 孔培养板，置于 （体积分数）、饱和湿度的培养箱中培养。后，分别加入 的、含药培养基继续培养，分别于、向待测孔板中避光加入（.，孔）溶液，孵育 后终止培养，平板离心机 离心 后，弃去上清培养液，每孔加入 ，置摇床震荡 ，待蓝紫色甲瓒完全溶解后，酶标仪测定 吸光度值。以对照第 期 成晓霞，等：活性氧在红缘拟层孔菌杀伤白血病细胞中的作用研究组的吸光值为空白对照调零，取至少 孔的平均值计算细胞的存活率，实验重复 次。按照公式：细胞存活率 （药物组 对照组）计算经过药物处理后的细胞存活率，结合药物的作用剂量，推算出药物对相应肿瘤细胞的半数抑制浓度，以此衡量药物的抗肿瘤活性。.细胞内活性氧检测荧光探针 是一种自身无荧光的亲脂性 指示剂，其进入细胞可被酯酶水解成无荧光形式的，后者可被胞内、等氧化成具有荧光的，在蓝光激发下产生绿色荧光，荧光的强弱与细胞内 水平呈正相关。实验组：细胞经不同剂量 处理，分别于、收集各组细胞；实验组：细胞经 的活性氧清除剂 乙酰半胱氨酸（）预孵育 后，加入 作用 ；实验组：细胞经 分别作用、。以上实验组收集细胞经 洗涤、重悬，加入终浓度为 避光孵育 ，在激发波长 、发射波长 条件下利用流式细胞仪检测，软件分析各组细胞平均荧光强度值（，）。试验重复 次。.细胞线粒体膜电位变化细胞线粒体具有内负外正的跨膜电位，能够摄入 阳 离 子 染 料 罗 丹 明 （，），发出绿色荧光，当线粒体膜发生损伤时，跨膜电位降低或消失，摄入的荧光染料减少，荧光会减弱。取对数生长期的 细胞，调节细胞密度为 ，向其中加入（、），分别于、离心收集各组细胞，洗涤、重悬，加入终浓度为 的 染液，避光孵育 ，流式细胞仪检测分析各组细胞。试验重复 次。.细胞质膜电位检测是一种自身无荧光的亲脂性阴离子荧光染料，当细胞膜去极化时，膜电位下降，可进入细胞与胞浆蛋白结合发出荧光。细胞经（、）作用 后离心收集细胞，洗涤、重悬，加入终浓度为 的，避光孵育 ，流式细胞仪检测分析各组细胞。试验重复 次。.细胞内钙离子浓度检测 进入细胞后可被脂解为，后者可与胞内游离的 特异性结合，产生的荧光强度与 浓度成正比。细胞经（、）处理 ，离心收集细胞，基础培养基洗涤、重悬，加入终浓度为 的，避光孵育 ，流式细胞仪检测分析各组细胞。试验重复 次。.细胞凋亡率测定 诱导 细胞凋亡率采用 试剂盒进行定量分析。用来检测凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸（，）外翻，而细胞膜非通透性染料 则作为细胞膜完整性受损导致细胞坏死的指示剂。密度为 的 细胞经（、）作用 后，收集细胞，按照试剂盒说明书要求，将 工作液与 细胞悬液混匀，避光孵育 ，立即进行流式细胞仪检测。试验重复 次，软件分析流式细胞仪检测结果。.数据处理试验数据以“平均值 标准差（?）”表示，采用 .统计软件进行单因素方差分析，选用 法进行显著性检验，.为差异具有统计学意义，多重比较结果用字母法进行标记。结果与分析.红缘拟层孔菌抗肿瘤活性组分筛选将、分别与小鼠白血病 细胞、人慢性髓系白血病 细胞、人急性单核白血病 细胞在实验条件下共孵育，结果见表。药物对细胞生长的半数抑制浓度与其细胞毒性呈反比，即 值越低，该药物的细胞毒性越强。对 而言，其对 种白血病细胞的 值均大于 ，故 与 的抗肿瘤活性优于。随着药物作用时间的延长，与 对 种白血病细胞的增殖抑制能力均呈现不同程度的增加。药物作用 后，对 细胞的 为（.），为供试药品中最小值，且其对 细胞的杀伤能力也优于，推断 是红缘拟层孔菌细胞毒性成分富集部位。相同条件下，将 与人胚肾上皮 细胞和 种白血病细胞共孵育（见图），西北大学学报（自然科学版）第 卷 的 作用后，、细胞的存活率分别下降至.、.、.，但 细胞的存活率为.；当 的剂量增加至 ，种白血病细胞的存活率均降至半数以下，而 细胞的存活率仍为.；以上结果提示，白血病细胞对 的作用更为敏感。表 红缘拟层孔菌极性组分的抗肿瘤活性分析 （）.图 细胞毒性分析 .对 细胞内 含量的影响细胞内荧光强度与 含量呈正比，由图 可见，可显著促进 细胞内 的生成，作用，的含量逐渐上升接近峰值，随着作用时间的延长逐渐回落，而当作用剂量下降为 时，药物作用 内，生成量稳步上升。当 作用 ，细胞内 水平随 剂量的增加逐步上升，差异显著（.），处理组细胞内 含量是对照组的.倍，而活性氧抑制剂 则可明显缓解细胞内 的增加（见图）；这一趋势可通过直方图直观反映，与对照组相比，的 作用可使细胞内 的荧光强度呈上升趋势，表现为峰形右移且峰高上升趋向尖锐，加入 后，峰形左移且锐度下降，说明细胞内 的荧光强度下降（见图）。然而，的 作用 细胞后，通过直方图观察到，个实验组峰形重叠，通过 值进行分析，组间无显著性差异（.），说明 并未引起 细胞内 水平的波动。.对 细胞线粒体膜电位的影响 细胞经 处理 后，与对照组相比（见图），细胞的荧光强度显著下降，说明药物处理后细胞线粒体膜电位快速丧失，外膜发生去极化；在不同剂量处理组中均能观察到，随着作用时间的延长，内细胞荧光强度均呈现下降趋势（见图）。通过流式细胞术直方图可直观显示，随着 剂量的增加，代表荧光强度的波峰明显左移，值显著下降（.），意味着细胞线粒体膜电位的下降与药物浓度呈正相关（见图）。.对 细胞质膜电位的影响 细胞与 共孵育 后（见图），随着药物作用剂量的增加，代表荧光强度的波峰明显右 移，细 胞 内 荧 光 强 度 显 著 增 加（第 期 成晓霞，等：活性氧在红缘拟层孔菌杀伤白血病细胞中的作用研究.）。表明 能够促使膜电位绝对值下降，诱导细胞发生严重去极化，且此趋势具有剂量依赖性。.对 细胞内钙离子含量的影响 作用 细胞 后（见图），与对照组相比，低剂量药物并不能影响细胞内钙离子的变化，而中高剂量作用后，直方图中的荧光峰明显右移，此时胞内平均荧光强度显著上升（.），说明、可显著提升细胞内钙离子浓度。注：不同字母表示组间差异显著 .。细胞内 随 作用时间的变化；作用 后，各处理组细胞 含量变化；对 作用下 细胞 的影响；作用不同时间对 细胞内 的影响图 对细胞内 生成的影响 注：不同字母表示组间差异显著 .。对细胞线粒体膜电位损伤的时间变化；作用 后，药物浓度对细胞线粒体膜电位损伤的影响图 对细胞线粒体膜电位的影响 .诱导 细胞凋亡的分析细胞凋亡是受到多基因调控的复杂生理过程，凋亡发生时位于细胞膜内侧的 外翻至细胞膜表面，与被荧光素 标记的 特异性结合，发出绿色荧光；而当细胞膜受损则可摄取，呈现红色荧光。图 中活细胞因细胞膜西北大学学报（自然科学版）第 卷完整呈现红绿荧光低染，位于点状图的左下角（）；当细胞出现早期凋亡的时候会表现出绿高红低，此时细胞位于右下角（）；随着细胞膜受损程度的加剧，细胞进入晚期凋亡，此时胞内红绿荧光强度均增加，细胞位于右上角（）；当胞内荧光绿低红高则表明细胞已经不可逆转地走向死亡（）。该实验重复 次，对其结果进行统计学分析结果见表，对照组细胞存活率为（.），随着 作用剂量由 增加至 ，活细胞比例降至（.）、（.），此时凋亡细胞由（.）骤 增 至（.）、（.）（.）；当 与高剂量药物组共孵育后，凋亡细胞的比例显著下降至（.）（.），同时伴随着细胞存活率明显回升到（.）。图 对细胞质膜电位的影响 图 对 细胞内钙离子含量的影响 图 对 细胞凋亡的影响 第 期 成晓霞，等：活性氧在红缘拟层孔菌杀伤白血病细胞中的作用研究表 对 细胞凋亡的影响 （）.注：不同字母表示组间差异显著 .。讨论肿瘤严重威胁着人类的健康，目前临床施用的手术、放疗、化疗等方法可在一定程度上缓解癌症患者的病情，但伴随而来的毒副作用也大大降低了患者的生存质量。随着科技的发展，层出不穷的分子层面个体化治疗方案也将部分患者从死神手中解救出来，但高昂的医疗费用也让许多患者及家庭望而却步。中草药药源广泛、价格低廉、应用历史悠久，具有不良反应少、遗传毒性低等优点，可以在治疗癌症的同时对机体的功能从根本上进行恢复，增强病人免疫力，延长生存期，是当前防治肿瘤新药研发的热点。本研究以体外培养的人慢性髓系白血病 细胞、人急性单核白血病 细胞、小鼠白