花生衣中儿茶素的提取与纯化工艺研究_倪沁颜.pdf

2023，32（1）福建分析测试Fujian Analysis&Testing花生衣中儿茶素的提取与纯化工艺研究倪沁颜（福建省测试技术研究所，福建福州350003）收稿日期：2022-8-24作者简介：倪沁颜（1977），女，工程师，从事分析化学工作，Email：摘要：花生衣中含有儿茶素等多种化学成分，具有抗氧化、抑菌以及防止血小板减少等药用活性，在食品、化妆品和医药等行业具有广泛的用途。本文探讨了儿茶素的提取工艺和纯化方法。结果表明从花生衣中提取儿茶素较适宜提取溶剂为甲醇，适宜提取时间为2 h，较适宜提取温度为50，料液比最佳为1：15。综合采用溶剂萃取和反相硅胶RP-C18、凝胶LH-20和正相硅胶等层析方法，可以获得儿茶素纯品，并根据核磁共振波谱数据对儿茶素的结构进行鉴定，从中获得一条从花生衣中提取儿茶素的较实用方法，可为花生衣的深度开发提供参考。关键词：花生衣；儿茶素；提取；纯化中图分类号：O657.7文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）01-0012-05Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.01.03Extraction and purification of catechin from peanut coatNi Qin-yan（Fujian Institute of Testing Technology，Fuzhou，Fujian 350003，China）Abstract:The peanut coat contains catechins and other chemical components.It possesses medicinal activities such as anti-oxidation，bacteriostasis，and the prevention of thrombocytopenia.It is widely used in food，cosmetics，medicine，and otherindustries.Based on the structural characteristics of catechin chemical molecules，the technique of extraction and purification of catechin from peanut were explored in this paper.The results indicated that the optimum solvent for extracting catechin from peanut coat was methanol，the optimum extraction time was 2 h，the optimum extraction temperature was 50，and the optimum ratio of material to liquid was 1：15.The pure catechin could be obtained by solvent extraction，reversed-phase silica gel RP-C18，Sephadex LH-20 and normal phase silica gel column chromatography.This paper provides a practical method to extract catechin from peanut coat，which would provide a reference for the in-depth development of peanutcoat.Key words：Peanut coat；Catechin；Extraction；Purification花生衣是花生（Arachis hypogaea）外表面的红棕色种皮，常作为传统中药，主治止血、散瘀、消肿，用于血友病、血小板减少性紫癜及各类出血症的治疗1-3。花生衣是花生糖、花生酥、花生八宝粥和花生豆等加工食品的副产物，每年大约有600 t，主要作为饲料使用。据分析，花生衣含有儿茶素、原花青素、白藜芦醇、维生素等活性物质，具有抗氧化4、防止血小板的减少和促进凝血的作用5-6。若将花生衣的这些活性成分提取纯化，用作药品和化妆品领域，可以变废为宝，提高花生的综合利用水平和经济价值。儿茶素是多酚类物质，具有抗氧化、抗癌变和抗辐射等作用；同时可以调理高血脂、高血压以及肠胃的功能7。儿茶素的还原性，可以把Fe3+还原成Fe2+，有利于人体对铁的吸收，适量的儿茶素对缺铁性贫血的改善具有一定的作用，研究也表明儿茶素可以刺激小鼠骨髓造血细胞的增殖8。本文综合利用溶剂萃取和柱层析法从花生衣中提取儿茶素，并进行核磁波谱确认，为从花生衣中提取儿茶素提供了一种新方法。122023，32（1）1材料与方法1.1材料花生衣由厦门众果食品科技有限公司提供。1.2药品与耗材柱层析硅胶（200-300目）和薄层层析板（0.20-0.25 mm，GF254）购自青岛海洋化工总厂。反相硅胶（RP-C18），Merck产品。凝胶层析硅胶（Sephadex LH-20），GE Healthcare产品。氘代甲醇（Methanol-d4）由青岛腾龙微波科技有限公司提供。甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、无水硫酸钠等试剂由国药控股有限公司提供。色谱乙腈（PN：5011403）由中谱科技有限公司提供。儿茶素标准品（RM0247）由成都麦德生科技有限公司提供。1.3仪器本文用到仪器主要有 BUCHI 中压制备系统（BUCHI），旋转蒸发仪（BUCHI，EYELA，STUART），核 磁 共 振 波 谱 仪（日 本 电 子，JNM-ECZ600R，600M），循环式多用真空泵（郑州长城科工贸易有限公司），自动分部收集器（S-100N，上海沪西分析仪器厂），电子分析天平（BSAZZXS，赛多利斯科学仪器有限公司），高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，Ultimate 3000）。1.4儿茶素的检测方法与标准曲线制作采用高效液相色谱法检测儿茶素。色谱柱采用 UMISiL C18 柱（Thermo Fisher Scientific，2504.6mm，5 m）。流动相为添加 0.1%甲酸的 10%乙腈水溶液。检测波长 280 nm；流速 1.0 mL/min；柱温30。1.5提取工艺研究1.5.1提取溶剂的选择称取10 g花生衣，分别加入100 mL甲醇、乙醇浸提8 h，过滤后减压浓缩，接着用乙酸乙酯和水1：1萃取，乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水，过滤后，于40水浴下，用旋转蒸发仪蒸干，得到有机粗提取物，用1 mL色谱纯甲醇溶解，经0.2 m有机滤膜过滤后进行HPLC分析。1.5.2提取时间的选择称取 10 g 花生衣于三角瓶中，加入 100 mL 甲醇，置于40恒温水浴中浸提1次，浸提时间分别设置为0.5、1、2、3、4、6、8 h。按上述相同方法制备供HPLC分析用的样品。1.5.3提取温度的选择称取 10 g 花生衣于三角瓶中，加入 100 mL 甲醇，于恒温水浴中浸提1次，浸提2 h，浸提温度分别设置为20、30、40、50、60、70、80。按上述相同方法制备供HPLC分析用的样品。1.5.4提取料液比的选择称取10 g花生衣于三角瓶中，分别加入50、75、100、125、150、200 mL 甲醇，于恒温水浴中浸提 1次，浸提2 h。浸提后按上述相同方法制备供HPLC分析用的样品。1.6纯化工艺研究取200 g花生衣，按照优化后提取条件，进行花生衣有机粗提物的制备，并依次采用反相C18（RP-C18）柱层析、凝胶SephadexLH-20柱层析和正相硅胶柱层析方法进行儿茶素的纯化，探讨3种柱层析的最佳流动相。1.7儿茶素的结构鉴定将获得的儿茶素溶于适量氘代甲醇中，进行核磁共振1H谱和13C谱检测，根据核磁共振氢谱和碳谱数据及数据库进行结构鉴定。2结果与分析2.1儿茶素的标准曲线将儿茶素配制成母液5 mg/ml，分别进样1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 L进行HPLC分析，以儿茶素峰面积作纵坐标，质量为横坐标，经计算，标准曲线线性回归方程为y=3.8038 x-7.8917，质量浓度与峰面积有显著线性关系，其R2=0.9953（图1）。450400350300250200150100500峰面积(Area)020406080100120儿茶素质量(g)图1儿茶素的标准曲线2.2提取工艺溶剂类型、提取时间、温度和料液比对儿茶素提取得率的影响见图2。由图可知，甲醇和乙醇较适合儿茶素提取，得率分别为195.7g/g和191.8g/g，水溶剂提取的得率最小为90.6g/g（图2-A）。倪沁颜：花生衣中儿茶素的提取与纯化工艺研究132023，32（1）福建分析测试研究报告随着浸提时间增长，提取液的儿茶素含量提高，在浸提2 h以后，儿茶素的得率没有显著变化，花生衣用甲醇浸提2 h左右，儿茶素提取率基本达到平衡（图2-B）。随着提取温度的升高，物质扩散系数增大，浸出量增大，在浸提温度为 20、30、40、50、60、70、80时儿茶素得率分别为 90.6、155.7、194.1、200.8、211.3、228.4、231.5 g/g，随着提取温度的上升，儿茶素提取得率明显提高，但当提取温度大于50时，提取得率上升趋势趋缓，综合溶剂沸点和能源消耗等因素，适宜的提取温度为50（图2-C）。随着料液比的增加，儿茶素得率也明显提高，料液比在1：15后，提取得率上升趋势趋缓，考虑到溶剂用量问题，设置提取料液比为 1：15 较适宜（图 2-D）。综合上述结果，从花生衣中提取儿茶素较适宜提取溶剂为甲醇，适宜提取时间为2 h，较适宜提取温度应设置为50，料液比最佳为1：15。AB提取时间0.51234568300.0250.0200.0150.0100.050.00.0儿茶素得率(g/g)C300.0250.0200.0150.0100.050.00.0儿茶素得率(g/g)浸提温度20304050607080300.0250.0200.0150.0100.050.00.0儿茶素得率(g/g)D300.0250.0200.0150.0100.050.00.0儿茶素得率(g/g)1:51:101:151:201:251:301:40料液比水甲醇乙醇溶剂类型图2溶剂类型、提取时间、温度和料液比对儿茶素得率的影响（A-溶剂类型；B-提取时间；C-浸提温度；D-料液比）2.3纯化工艺按照优化后提取条件，进行花生衣有机粗提物的制备。取 500 g 花生衣，加入 7.5 L 甲醇于恒温50浸提2 h，过滤后甲醇减压浓缩，获得14 g提取物，接着用乙酸乙酯和水1：1萃取，乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水，过滤后，在40的水浴锅用旋转蒸发仪蒸干，萃取5次，得到花生衣有机粗提取物8.0 g。2.3.1反相层析将获得的花生衣粗提物用适量甲醇充分溶解，采用反相 C18 柱（填料 170 g）进行柱层析，分别用水、30%、50%、70%、100%甲醇水为洗脱剂各洗脱1.5 L，流速控制为20 mL/min，每管收集250 mL，将收集到的各管溶液，40减压浓缩，各梯度洗脱剂分别获得6个洗脱液，取100 L进行HPLC分析，各洗脱液的儿茶素含量见图3。由图3可知，儿茶素主要由30%甲醇水梯度为流动相洗脱得到。结果说明以RP-C18为色谱分离介质时，可使用30%甲醇水为洗脱剂。将含有儿茶素洗脱组分合并后蒸干，得到1.19 g，经计算，含有11.4 mg儿茶素，含量为9.56%。图3反相层析图（注：A1-6：纯水洗脱收集管号；B1-6：30%甲醇水洗脱收集管号；C1-6：50%甲醇水洗脱收集管号；D1-6：70%甲醇水洗脱收集管号；E1-6：100%甲醇水洗脱收集管号）2.3