核壳型松香基高分子键合硅胶...相色谱固定相高效分离紫杉醇_李浩.pdf

第 43 卷第 1 期2023 年 2 月林产化学与工业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol 43 No 1Feb 2023收稿日期:2021-11-17基金项目:国家自然科学基金资助项目(32060325)作者简介:李 浩(1985)，男，河南周口人，博士生，主要从事天然产物的开发及功能材料研究工作*通讯作者:雷福厚，教授，博士，博士生导师，研究领域为林产化工及功能高分子;E-mail:leifuhougxun126 com。doi:10 3969/j issn 0253-2417 2023 01 004核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇LI Hao李 浩，谢文博，曾 磊，易柳钰，李 文，雷福厚*(广西民族大学 化学化工学院;林产化学与工程国家民委重点实验室;广西林产化学与工程重点实验室;广西林产化学与工程协同创新中心，广西 南宁 530006)摘要:将富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯(FATE)通过自由基聚合反应键合到烷基化硅胶(TPM-SiO2)表面，制备了核壳型松香基高分子键合硅胶(P SiO2)固定相，对 P SiO2固定相进行了一系列表征和评价，探讨了 P SiO2柱对紫杉醇(PTX)及其类似物的分离性能和分离机理，并将其用于红豆杉树皮粗提物中 PTX 的分离纯化。结果表明:FATE 成功键合在硅胶表面，核壳型结构材料成功制备，P SiO2的平均粒径约为 5 m;P SiO2柱是类似于 C18 柱的典型反相色谱柱，表现出优异的色谱性能、良好的重现性和典型的反相色谱行为;采用 P SiO2柱分离紫杉醇类似物，连续洗脱样品的分离度均超过 6 6。计量置换保留理论(SDT-)和 van t Hoff 热力学分析结果表明:疏水相互作用决定了分析物的保留，在 P SiO2柱上分离紫杉醇类似物是一个焓驱动的放热过程，SDT-可用于解释其保留机理。采用 P SiO2柱从红豆杉树皮粗提物中分离纯化紫杉醇，紫杉醇的纯度由 6%提高到 81%。关键词:松香基固定相;高效液相色谱;保留机理;紫杉醇中图分类号:TQ35;O658文献标志码:A文章编号:0253-2417(2023)01-0034-09引文格式:李浩，谢文博，曾磊，等 核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇J 林产化学与工业，2023，43(1):3442Highly Effective Separation of Paclitaxel by Using Core-shell osin-basedPolymer Bonded Silica as Liquid Chromatography Stationary PhaseLI Hao，XIE Wenbo，ZENG Lei，YI Liuyu，LI Wen，LEI Fuhou(School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Minzu University;Key Laboratory of Chemistry and Engineering ofForest Products，State Ethnic Affairs Commission;Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products;Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products，Nanning 530006，China)Abstract:A rosin-based core-shell polymer bonded silica(P SiO2)stationary phase was prepared by the radical polymerizationof fumaropimaric acid tri(-acryloxyl ethyl)ester(FATE)onto alkylated silica(TPM-SiO2)The P SiO2stationary phase wascharacterized and evaluated，the separation performance and mechanism of P SiO2column for paclitaxel(PTX)and its analogswere discussed，and it was used for the separation and purification of PTX from crude yew-bark extract The results showed thatFATE was successfully bonded to the surface of silica，the core-shell structure material was successfully prepared，and theaverage particle size of P SiO2was about 5 m The P SiO2column was a typical reversed-phase column similar to C18column，showing excellent chromatographic performance，satisfactory performance reproducibility，and typical reversed-phasechromatographic behavior The P SiO2column was used to separate paclitaxel analogs，and the separation degree of continuouselution samples was more than 6 6 Stoichiometric displacement theory for retention(SDT-)and van t Hoff thermodynamicanalysis showed that hydrophobic interactions determined the analyte retention，and the separation of paclitaxel analogs on第 1 期李 浩，等:核壳型松香基高分子键合硅胶液相色谱固定相高效分离紫杉醇35P SiO2column was an exothermic process driven by enthalpy Furthermore，SDT-could be used to explain its retentionmechanism The P SiO2column was employed to separate and purify paclitaxel from crude yew-bark extract，increasingpaclitaxel purity from 6%to 81%Key word:rosin-based stationary phase;HPLC;retention mechanism;paclitaxel紫杉醇是从红豆杉中提取的一种二萜类抗癌药物，因其对食道癌、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等有防治效果而受到广泛关注1 3。通过植物细胞培养、化学半合成、化学全合成等方法也可以获取紫杉醇，但是这些方法步骤繁琐且纯化成本较高4。因此，从天然资源红豆杉中提取紫杉醇，仍是分离纯化紫杉醇的主要途径。红豆杉中紫杉醇的含量很低，而且有很多类似物与紫杉醇共存，如三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇、巴卡亭、10-脱乙酰基巴卡亭等，使得紫杉醇的分离纯化面临较大挑战5。有文献报道采用分子印迹法有较好的选择性，但制备过程复杂且成本较高2，6。因此，开发一种高效分离纯化紫杉醇的方法是该领域热点问题之一。高效液相色谱(HPLC)是分离测定紫杉醇及相关化合物最常用的分析方法。固定相是高效液相色谱体系的关键组成部分，在液相分析中起着关键的作用7。因此，开发新型色谱固定相用于紫杉醇的分离和纯化具有重要意义。松香是含有双键、羧基和类菲环骨架的二萜类树脂酸，具有天然、环保、可降解等优点，通过对松香进行改性可得到松香衍生物8 9。本课题组前期工作中，制备了一系列松香基聚合物固定相，用于分离喜树碱10、盐酸小檗碱11 和咖啡因12。然而，松香基聚合物固定相的机械强度和柱效较低，分离效果较差。硅胶粒径均一、机械强度高且孔结构丰富，在制备化学键合固定相时常被用作基体。因此，基于前期研究结果，本研究将富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯通过自由基聚合反应键合到烷基化硅胶表面，制备了核壳型松香基高分子键合硅胶(P SiO2)固定相，表征了 P SiO2的结构，评价了 P SiO2柱的色谱性能、重现性和反相色谱行为，并探讨了流动相组成、流速和温度等参数对紫杉醇类似物分离的影响;此外，进一步研究了化学计量置换保留理论(SDT-)、色谱热力学，以阐明分离机理;最后，利用 P SiO2柱从红豆杉树皮粗提物中分离纯化紫杉醇，以期为红豆杉中紫杉醇的分离纯化提供新思路。1实 验1 1材料与仪器富马海松酸三(-丙烯酰氧基乙基)酯(FATE，纯度 95%)，广西鼎弘树脂有限公司;球形硅胶(粒径5 m，比表面积 360 m2/g)，苏州纳微科技股份有限公司;3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(TPM，纯度 97%)、偶氮二异丁腈(AIBN，纯度 99%)、10-脱乙酰基巴卡亭(10-DAB，98%)、巴卡亭(BCT，99%)、10-去乙酰紫杉醇(10-DAT，98%)、三尖杉宁碱(CEP，98%)、紫杉醇(PTX，99%)，均购于上海阿拉丁公司;甲醇、乙腈(色谱纯)，美国 Fisher Scientific 公司;其他试剂均为市售分析纯。Zeiss Supra 55 Sapphire 扫描电镜，德国蔡司公司;Tecnai-G2-F30 FEI 透射电镜，美国 FEI 公司;Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱分析仪，美国 Nicolet 公司;TG 209 F1 Libra 热重分析仪，德国 Netzsch公司;Vario EL cube 有机元素分析仪，德国 Elemantar 公司;ASAP2020 比表面积及微孔物理吸附仪，美国Micromeritics 公司;CP-24 装柱机，美国 Scientific Systems 公司;LC-15C 高效液相色谱仪、LC-20A 制备型液相色谱仪，日本岛津公司。1 2固定相的制备称取 5 0 g 硅胶加入到盛有 100 mL 盐酸溶液(2 0 mol/L)的 250 mL 三口圆底烧瓶中，氮气保护，75 条件下反应 8 h。产物用去离子水洗涤，除去盐酸至水溶液呈中性，在 80 下真空干燥 24 h，得到活化硅胶。将 5 g 活化硅胶置于 250 mL 单口烧瓶中，加入 50 mL 无水甲苯、5 mL 硅烷偶联剂 TPM，在氮气保护下回流反应 8 h。反应结束后，减压抽滤收集 TPM 修饰的硅胶，依次用丙酮、甲醇和正己烷洗涤，于 80 真空干燥过夜，得到烷基化硅胶(TPM-SiO2)。将 FATE(0 92 g)、AIBN(0 05 g)溶于 3 mL氯仿中，超声波处理使其均匀分散，配成油相。称取硅胶质量 5%的油相溶于 30 mL 氯仿配成混合溶液，将上述混合溶液涂覆到 TPM-SiO2表面，并置于盛有十二烷基硫酸钠水溶液(3 g SDS 溶于 100 mL36林产化学与工业第 43 卷水)的 250 mL 单口烧瓶中，在 85 和 95 条件下各反应 2 h。反应结束后，减压抽滤，收集固体，用无水乙醇洗涤，于 80 真空干燥过夜，得到核壳