黄瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选、鉴定和防效测定_兰成忠.pdf

39(1)184-193 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-03-10 基金项目：福建省公益院所科研专项（2022R1024008）；福建省农业科学院科技创新平台专项（CXPT202105）；福建省人民政府-中国农业科学院农业高质量发展超越“中国农业科学协同创新工程”（XTCXGC2021011）作者简介：兰成忠，博士研究生，E-mail：；*通信作者，教授，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.006 黄瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选、鉴定和防效测定 兰成忠1,2，甘 林1，代玉立1，刘晓菲1，杨秀娟1，蒋军喜2*（1.福建省作物有害生物绿色防控工程中心/福建省农业科学院植物保护研究所，福州 350013；2.江西农业大学农学院，南昌 330045）摘要：为获得对黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum（FOC）具有拮抗作用的生防菌株，采用稀释涂布平板和平板生长对峙法从健康黄瓜根际土壤中分离、筛选对 FOC 具有强拮抗能力的拮抗细菌，并从形态学观察、生理生化特性、全细胞脂肪酸分析及 16S rRNA 和 gyrB 基因序列相似性对拮抗能力最强的菌株进行鉴定，同时测定拮抗菌无菌过滤发酵液对 FOC 菌丝生长、孢子萌发的抑制作用，并评价其发酵液对盆栽和大田黄瓜枯萎病的防治效果。研究结果显示，从健康黄瓜根际土壤中分离获得 23 株对FOC 具有拮抗作用的细菌，其中菌株 FJ17-4 对 FOC 抑菌作用最强，鉴定为贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis。FJ17-4 抑制 FOC 引起菌丝畸形、扭曲、膨胀、皱缩、缠绕等异常现象。10%无菌过滤液对 FOC菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为 70.96%和 85.40%。50 倍发酵液、菌体悬浮液和无菌过滤液盆栽防治效果分别为 70.20%、58.87%和 47.80%，大田防治效果分别为 69.53%、58.46%和 36.12%。综上，FJ17-4能有效抑制 FOC，对黄瓜枯萎病具有显著的生防效果，具有广泛的应用前景。关 键 词：黄瓜枯萎病；尖孢镰刀菌黄瓜；生物防治；贝莱斯芽胞杆菌 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0184-10 Screening,Identification and Biocontrol Effect of Antagonistic Strain against Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum LAN Chengzhong1,2,GAN Lin1,DAI Yuli1,LIU Xiaofei1,YANG Xiujuan1,JIANG Junxi2*(1.Fujian Engineering Research Center for Green Pest Management/Institute of Plant Protection,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China;2.College of Agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)Abstract:In order to obtain biocontrol strains with high antagonistic activity against Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum(FOC),antagonistic bacterial strains against FOC were isolated and screened from healthy cucumber plants rhizosphere soils by soil dilution plating and plate confrontation growth methods.The strain with the strongest antagonistic ability was identified based on morphological characteristics,physiological and biochemical indexes,whole cell fatty acids in combination with 16S rRNA and gyrB gene sequence homology analysis.Meanwhile,the inhibitory effects of antagonistic strain cell-free fermentation filtrate on mycelial growth and spore germination of FOC were determined,and the control effects of fermentation liquid on cucumber Fusarium wilt in greenhouse potted and field experiments were further evaluated.The results showed that 23 strains of bacteria with inhibitory activity against FOC were primarily screened out,and one strain FJ17-4 which exhibited the strongest inhibition capability was identified as Bacillus velezensis.FJ17-4 could seriously disrupt FOC mycelium growth and caused abnormal phenomena such as mycelial deformity,distortion,swelling,shrinkage and curling.The inhibition rates of 10%cell-free fermentation filtrate of FJ17-4 on mycelial growth and spore germination were 70.96%and 85.40%,respectively.In addition,the control effects of 50 fold fermentation liquid,living bacterial cell 第 1 期 兰成忠等：黄瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选、鉴定和防效测定 185 suspension and sterile filtrate of strain FJ17-4 on cucumber Fusarium wilt were 70.20%,58.87%and 47.80%in potted experiment,and 69.53%,58.46%and 36.12%in field trials,respectively.In summary,FJ17-4 could effectively inhibit FOC and exhibited significantly biological control effect on cucumber Fusarium wilt,and had broad application prospects.Key words:cucumber Fusarium wilt;Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum;biocontrol;Bacillus velezensis 由尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum侵染引起的枯萎病是黄瓜生产上的毁灭性病害之一，该病害在黄瓜种植区普遍发生，严重影响黄瓜的产量、品质和效益，常造成重大经济损失1。目前生产上防治黄瓜枯萎病主要措施有种植抗性品种、抗性钻木嫁接苗及施用化学药剂等，这些防治方法虽然取得了一定的防治效果，但也存在着优质抗性品种资源缺乏、嫁接育苗成本高、化学药剂污染环境等诸多弊端2-4。在大力倡导绿色农业、有机农产品和生态安全的背景下，黄瓜枯萎病的绿色、安全有效防治已成为该病害的研究热点。近年来，利用有益微生物是调控植物根部病害的一条有效途径。自然界中存在着种类极其丰富的对植物病害具有防治作用的微生物资源，研究人员已从不同生态环境中分离、筛选出了对黄瓜枯萎病具有一定防治效果的木霉菌5、放线菌6和芽胞杆菌7等拮抗菌，如 Cheng 等5从土壤中分离、筛选获得了一株对黄瓜枯萎病具有防治效果的哈茨木霉 Trichoderma harzianum SQR-T037，该菌株的有效抗菌物质为 6-戊基-吡咯烷（6PAP），350 mg/L 6PAP 对黄瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为 73.7%和 79.6%，150 mg/L 6PAP 对枯萎病菌分生孢子和镰刀菌酸的抑制效果分别为 88.05%和 52.68%，田间试验结果显示，当 6PAP 浓度为 350 mg/Kg 时，对连作地黄瓜枯萎病的防治效果为 78.1%89.6%。刘金秀等6从盐碱地土壤中分离获得了一株毒三素链霉菌 Streptomyces toxytricini XF-7，该菌株不仅对黄瓜枯萎病菌的分生孢子萌发和菌丝生长具有抑制作用，而且对苗期黄瓜枯萎病的防治效果达 79.57%以上。韦巧婕等7研究发现，一株分离自黄瓜根际土壤的芽胞杆菌 Bacillus ssp.与有机肥结合形成的微生物有机肥（BIO）对黄瓜枯萎病的平均防治效果达 80.7%。上述研究表明，从自然环境中分离筛选到抑制黄瓜枯萎病菌的拮抗菌对黄瓜枯萎病具有一定的防治效果，但受菌株自身特性和环境条件等因素的影响，真正能应用于生产实际，且能取得理想防治效果的菌株资源并不丰富。为进一步挖掘对黄瓜枯萎病具高效防治作用的优质生防菌，本研究以黄瓜枯萎病菌为靶标，从健康黄瓜植株根际土壤中分离、筛选到一株对目标病菌具有抑制作用的拮抗细菌 FJ17-4，通过培养特征、形态学、生理生化及16S rRNA和gyrB基因序列分析对其进行分类鉴定，并初步进行抑菌活性测定和防治效果评估，以期为黄瓜枯萎病生物防治提供新的菌种资源，为生防菌剂的研发和应用奠定研究基础。1 材料与方法 1.1 材料 黄瓜尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum FOC-1 由福建省农业科学院植物保护研究所植物病理研究室提供；土壤采自于福建省闽清县蔬菜种植基地健康黄瓜根际约 1530 cm 深土层土，于室内自然风干；黄瓜品种津研 4 号为天津市农业科学院蔬菜研究所选育，购于蔬菜种子市场；98%噁霉灵可溶粉剂（天津市绿亨化工有限公司，PD20190146）购自农药市场；供试培养基分别为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（去皮马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂粉 17 g、蒸馏水 1000 mL）和 LB 培养基（酵母提取物 5 g、胰蛋白胨 10 g、氯化钠 10 g、蒸馏水 1000 mL、pH 7.2；固体 LB 加琼脂粉 17 g）。1.2 拮抗菌分离和筛选 采用潘晓梅等8土壤稀释涂布法分离土壤细菌，初步根据菌落形态差异，挑取不同形态特征的单菌落于新的 LB 平板中进行纯化，纯化后的单菌落细菌悬浮于 15%甘油中，置-80 超低温冰箱中保存、备用。参考黄新琦等9平板对峙法筛选对黄瓜枯萎病菌具抗拮作用菌株：将 FOC-1 菌饼（直径 5 mm）接种