华东山茶花腐病病原菌分离鉴定_普梅英.pdf

浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):121 127http:/www zjnyxb cn普梅英，武自强，张诗文，等 华东山茶花腐病病原菌分离鉴定 J 浙江农业学报，2023，35(1):121 127DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.13收稿日期:2022-04-07基金项目:国家重点研发计划(2019YFD100100005);云南省教育厅科学研究基金(2021Y259，2021J0172);西南山地森林保育与利用教育部重点实验室开放基金(KLESWFU-202005);国家基础科学公共科学数据中心“世界山茶属植物品种数据库”(NBSDC-DB-03)作者简介:普梅英(1997)，女，彝族，云南玉溪人，硕士研究生，研究方向为风景园林植物。E-mail:670868861 qq com*通信作者，王超，E-mail:47188127 qq com华东山茶花腐病病原菌分离鉴定普梅英，武自强，张诗文，李艳杰，朱幼娇，吴坤，陈龙清，王超*(西南林业大学 国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南省森林灾害预警与控制实验室，云南 昆明 650224)摘要:华东山茶(Camellia japonica L)花腐病对华东山茶的观赏性影响极其严重，为明确华东山茶花腐病的致病菌及其生物学特性，提升华东山茶花期品质和观赏价值，采用组织分离法对云南省昆明市昆明植物园华东山茶的花腐病进行病原菌分离，并进行致病性测定、形态学和分子生物学鉴定。结果表明，从华东山茶品种 五彩(C japonicaWucai)的病组织中分离得到 1 株菌株，其在 PDA 培养基上为白色菌丝，培养 7 d长出黑色的分生孢子;将分离菌株回接于华东山茶品种 五彩 健康花瓣上，接种后划破的花瓣病症较为明显，花朵失色变黄褐，严重时花瓣干腐或湿腐，并且产生分生孢子，与田间的症状一致;经过多引物(ITS、LSU、-tubulin)合并系统发育分析，分离菌株与葡萄牙拟盘多毛孢(Pestalotiopsis portugallica)聚集在同一分支。综上可知，引起华东山茶花腐病的病原菌为葡萄牙拟盘多毛孢(P portugallica)，这是葡萄牙拟盘多毛孢(Pportugallica)侵染华东山茶花朵引起华东山茶花腐病的首次报道。关键词:华东山茶;花腐病;葡萄牙拟盘多毛孢;致病性中图分类号:S432.4+4;S685.14文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0121-07Isolation and identification of petal blight disease of Camellia japonicaPU Meiying，WU Ziqiang，ZHANG Shiwen，LI Yanjie，ZHU Youjiao，WU Kun，CHEN Longqing，WANG Chao*(Southwest Research Center for Engineering Technology of Landscape Architecture(State Forestry and Grassland Ad-ministration)，Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization，Key Labo-ratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China)Abstract:The ornamental effect of Camellia japonica petal blight disease was very serious In order to identify thepathogenic bacteria and biological characteristics of C japonica petal blight disease and improve the quality and orna-mental value of C japonica，and provide the basis for prevention and control The pathogen of petal blight disease ofC japonica from Kunming Botanical Garden in Kunming City was isolated by tissue separation method，and patho-genic bacteria were identified by pathogenicity assay，morphological and molecular biological identification Onestrain was isolated from the C japonicaWucaidiseased tissue，there was white hyphae on PDA medium and hadblack conidia in the later stage of culturing for 7 days when it was connected back to the healthy petals，the diseaseof lacing petals after inoculation was more obvious，which could cause the flowers to become yellow and brown Whenit was serious，it could make the petals dry rot or wet rot，and grew mycelium，which was consistent with the symp-toms in the field and conformed to the pathogenicity determination of Kochs rule Based on the phylogenetic analysisof multiple primers(ITS，LSU，-tubulin)，Pestalotiopsis portugallica clustered in the same clade It was confirmedthat the pathogen of petal blight disease of C japonica was P portugallica This was the first report that P portugal-lica infected the flowers of C japonica and caused petal blight diseaseKey words:Camellia japonica;petal blight disease;Pestalotiopsis portugallica;pathogenicity华东山茶(Camellia japonica L)又名日本山茶，分布于中国山东半岛、浙江沿海、台湾北部，以及日本和朝鲜半岛南部，叶椭圆形，革质，边缘具锯齿，表面深绿色，叶背具褐色腺点，外轮花丝合生程度较高。其树形美观，花朵鲜艳，极具观赏价值，是优良的园林绿化树种，已成为世界流行的园林观赏树种1，也是我国十大名花之一2。华东山茶的花期从秋末开始，陆续绽放直至翌年春季，整个花期长达 5 个月，是冬季的主要观花种类3。山茶常见的病害有枝枯病、花腐病、炭疽病、花叶病、媒污病等4 6。随着山茶花栽植面积的扩大，山茶的花腐病肆虐，是全世界茶花观赏的一大难题7，是目前亟待解决的问题。有研究认为，山茶花腐病是由山茶叶杯菌(Ciborinia camelliae)侵染所致8 9，也有研究认为，山茶花腐病是由山茶核盘菌(Sclerotinia ca-melliae)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致10，笔者先前也报道过假螺卷毛壳菌(Chaeto-mium pseudocochliodes)导致云南山茶花腐病的发生11。前人对不同病原菌引起的山茶花花腐病进行了相关研究，但对于云南地区的华东山茶花花腐病研究还未见报道。笔者通过调查发现，昆明主要山茶园的花腐病发病率达 65%以上，在云南楚雄紫溪山也存在严重的花腐病发生情况。本研究采集昆明植物园感病华东山茶花，通过组织分离、致病性验证、病原菌形态学和分子生物学，鉴定了该病害的病原种类，为华东山茶花腐病防治和抗病育种提供科学依据。1材料与方法1.1供试材料植物材料:感病的华东山茶品种 五彩(Ca-mellia japonicaWucai)于2021 年1 月7 日采于云南省昆明植物山茶园(2583.48N，1024445.38E)中，病株表现为部分花瓣出现不同程度的黄棕色且干腐或湿腐，甚至在花瓣基部长出菌丝体和子实体，直至侵染整朵花并掉落(图 1-a、1-b)。供试培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 17 g，加水定容至 1 000 mL。1.2病原菌的分离纯化采用组织分离法12 将花瓣放入 75%乙醇 30s，用无菌水漂洗;再放入 1%次氯酸钠 30 s，用无菌水漂洗 3 次，放在灭菌滤纸上晾干;剪除花瓣上彻底病死的部分，剪取花瓣的病健交界处(5mm 5 mm 或其他形状规则小块)，置于 PDA表面，及时封口，并做标记，重复 3 次。倒置装入自封袋，放于 25 恒温培养箱中培养 3 7 d，每天观察是否长出菌丝，是否污染，并拍照作好记录，待长出真菌菌丝后，进行分离纯化。1.3致病性测定在真菌菌落边缘，用 5 mm 打孔器打取菌饼。用无菌接种划伤山茶花瓣，在伤口上放置菌饼(气生菌丝面向伤口)，以放置无菌 PDA 做空白对照，重复3 次。接种后用沾无菌水的棉花保湿培养诱导发病。每日拍照并记录描述花朵状态 13。1.4形态学鉴定将纯化后得到的菌株转接到 PDA 培养基上，于 25 培养箱中培养 7 d，记录菌落特征(正反面颜色、形状、质地等)。待产生分生孢子后，显微镜下观察产孢结构，以及分生孢子形状和大小，并拍照记录14 16。1.5分子生物学鉴定采用真菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒进行DNA 提取，利用引物 ITS1 和 ITS4、NL1 和 NL4、BT-2A 和 BT-2B(表 1)进行 PCR 反应，分别获取内部转录间隔区(ITS)区间、核糖体大亚基(LSU)区间、微管蛋白(-tubulin)区间的 DNA序列。221浙江农业学报第 35 卷第 1 期a，田间健康花症状;b，田间感病花症状;c，菌落;d，分生孢子;e、f，室内离体接种后花腐症状。a，Healthy flowers in field;b，Symptom on flowers in field;c，Colony morphology;d，Conidium;e and f，Symptom on Camellia japonica flow-ers after inoculation图 1菌株 23h 形态特征观察Fig 1Morphological characteristics of strain 23h表 1引物序列Table 1Primer sequences基因名称Gene name引物Primer序列Sequence(53)ITS17 ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4TCCTCCG