河南省部分地区蛋鸡场螨虫的种类鉴定_菅忆晨.pdf

2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医河南省部分地区蛋鸡场螨虫的种类鉴定河南省部分地区蛋鸡场螨虫的种类鉴定菅忆晨1，郭庆2，李是衡1，李静1，刘帅奇1，许会艳1*，菅复春1*（1.河南农业大学动物医学院，河南郑州450046；2.河南和牧动物制药有限公司，河南郑州451468）摘要：为了解河南地区鸡螨虫病中的常见感染种类，试验采集了河南10个地区阳性蛋鸡场样品，采用形态学鉴定及基于鸡皮刺螨的18 S rRNA基因序列进行PCR扩增。结果显示：新乡市、开封市、平顶山市等8个地区采集8个阳性鸡场的样品虫体呈椭圆形，前端有长的口器，后部稍宽，肛板呈圆三角形，符合鸡皮刺螨的形态特征；在新乡市原阳县和周口市商水县白寺镇采集2个阳性鸡场样品虫体细长，整体小于鸡皮刺螨，肛板位于腹部末端，呈泪滴状，符合林禽刺螨形态特征；河南地区流行的鸡皮刺螨与日本LC034951.1基因序列相似性达100%，林禽刺螨和法国的FN646503.1基因序列相似性达98.72%。表明鸡皮刺螨和林禽刺螨已经在河南省蛋鸡中出现感染和分布。关键词：鸡皮刺螨；林禽刺螨；形态学鉴定；PCR检测；河南地区；蛋鸡中图分类号：S855.9文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-27-06收稿日期：2022-03-30；修回日期：2022-07-17基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-38）作者简介：菅忆晨（1996-），女，硕士研究生，研究方向为动物寄生虫病防控，E-mail：*通讯作者：许会艳（1985-），女，硕士，实验师，主要从事寄生虫病学研究，E-mail：；菅复春（1971-），女，博士，教授，主要从事动物寄生虫防控研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.005Species Identification of Mites in Layer Farms in Some Areas of Henan ProvinceJIAN Yichen1,GUO Qing2,LI Shiheng1,LI Jing1,LIU Shuaiqi1,XU Huiyan1*,JIAN Fuchun1*（1.College of Animal Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou,Henan 450046；2.Hemu Animal Pharmaceutical Co.,Ltd.,Zhengzhou,Henan 451468）Abstract:In order to understand the common infection species of chicken mite disease in Henan province,samples were collected from 10 positive layer farms in 10 regions of Henan province.Morphological identification and PCR amplification were performed based on 18 S rRNA gene sequences of Dermanyssus gallinae.The results showed that the insect bodies isolated from thesamples which were collected from the 8 positive chicken farms in 8 areas in Xinxiang city,Kaifeng city and Pingdingshan city,were oval in shape,with a long mouthpiece at the front end,a slightly wider posterior part,and a circular triangle in the plate,which were identified as conforming to the morphological characteristics of Dermanysus gallinae.Samples of 2 positive chickenfarms collected from Yuanyang county,Xinxiang city and Baisi town,Shangshui county,Zhoukou city were similar to the Dermanysus gallinae in morphology.The overall size was smaller than Dermanysus gallinae,and the anal plate was located at the end ofthe abdomen in the shape of a tear drop,which was identified to be consistent with the morphological characteristics of Ornithonysus sylviarum.Sequencing and phylogenetic analysis showed that Dermanysus gallinae was 99%homologous with LC034953.1from Japan,and Ornithonysus sylviarum was 98.72%homologous with FN646503.1 from France.It was indicated that the infec-272023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医鸡螨虫是以吸食鸡血为生的一类体外寄生虫。鸡群发病后表现为易惊恐、食欲减退、贫血、消瘦、产蛋下降等症状1。鸡螨虫体型微小，可以寄生于宿主身体的任何部位。在全球养禽行业广泛流行，每年可造成数百万欧元的损失2。除此之外，鸡螨虫是多种病原的传播者。可通过叮咬鸡体传播沙门菌、伯氏螺旋体、伯纳特氏立克次氏体等多种病原3，同时也是东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、黄病毒等多种人兽共患病原的携带者4-5。鸡螨病中的螨虫种类很多，较常见的主要为鸡皮刺螨和林禽刺螨6。鸡皮刺螨（Dermanyssus gallinae）又称家禽红螨（Poultry red mite，PRM），是一种以吸食禽类、鸟类以及人类血液为生的永久性体外寄生虫7。鸡皮刺螨没有特定的寄生部位，主要在夜间侵袭宿主，白天喜欢藏匿在鸡笼缝隙和食槽中。鸡皮刺螨繁殖迅速，在不受控制的条件下，严重感染时每只蛋鸡寄生的鸡皮刺螨可达50 000只，严重影响蛋鸡采食量以及产蛋质量、产蛋率8。鸡皮刺螨的暴发感染不仅对养禽业可造成严重危害，对人类的健康也具有一定威胁，近年来接连有人感染鸡皮刺螨的报道9-10，叮咬人后，可引起皮肤瘙痒、红疹、皮炎和荨麻疹等皮肤病。林禽刺螨（Ornithonyssus sylviarum）又称北方鸡螨（Northern fowlmite，NFM），吸食禽类、鸟类的血液为生11。据报道，北美超过70种野生鸟类可作为林禽刺螨的宿主，其中包括八哥、家雀等12。林禽刺螨形态与鸡皮刺螨相似，但是生活史和寄生部位不同。林禽刺螨常常寄生在鸡体肛门周围，不论白天还是黑夜都寄生在宿主身上。在冬天寒冷的季节感染数量会增多，夏季减少13。鸡皮刺螨和林禽刺螨在欧洲、日本和我国大部分省、市和自治区均有发现14-16，为了解河南省养禽场鸡螨虫病的感染种类，本试验对河南省地区的阳性蛋鸡场中采集的鸡螨虫样品进行形态观察和基因型鉴定，为河南地区鸡螨虫病的防治提供科学依据。1材料与方法1.1主要试剂及仪器主要试剂：DNA Mini Kit 试剂盒（QIAamp 公司），KOD-plus酶（日本TOYOBO公司）。主要仪器：体视显微镜（SMZ-16型，上海徕卡显微系统有限公司）；PCR仪（美国BIO-RAD公司）；低速离心机（TGL-16B 型，赛默飞世尔科技）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。1.2样品采集2021年611月对河南省新乡市卫辉县和原阳县、开封市祥符区、开封市杞县、开封市通许县、平顶山市汝州县、周口市商水县白寺镇和练集镇、周口市郸城县、洛阳市汝阳县10个地区的患病蛋鸡场的鸡笼、食槽、鸡体表等鸡舍设备上，用棉签轻挑螨体放入4号自封袋中，每个鸡场至少采取10份不同位置的样品，共采集100份样品。记录蛋鸡发病时间、临床症状、用药情况等，之后带回实验室4 保存待检。1.3样品处理将采集好的样品分装成两份，一份分出24只螨虫置于2 mL离心管中用于后续基因组的提取及分子生物学检测；一份置于80%酒精固定活螨，使螨体附肢伸直，以便于用于形态学鉴定。1.4玻片标本制备将消化完全固定好的螨虫使用蒸馏水反复清洗；用5%氢氧化钠浸泡虫体至呈黄色透明状；再使用蒸馏水将虫体的碱充分冲洗干净，晾干水分；之后取干净载玻片，滴一滴加拿大树胶，将整理清洗完毕待检的螨虫放入；放置在体视显微镜下，使用昆虫针摆正姿势，各足伸展；轻轻盖上盖玻片，若是螨体不伸展，放在酒精灯上稍稍加热使其伸展，然后倒转玻片，螨虫头部朝上，贴上标签；放入45 烘箱内烘干即可。1.5电镜样本制备将消化清洗好的螨虫放置在含有4%戊二醛的1.5 mL离心管中，使螨虫沉入管底，在4 冰箱过夜；将离心管中戊二醛使用针管抽走，加入PBS清洗10 min，可重复清洗，直到将戊二醛清洗干tion species of chicken mite disease in Henan area were Dermanysus gallinae and Ornithonysus sylviarum,which had been infected and distributed in layer of Henan province.Key words:Dermanysus gallinae;Ornithonysus sylviarum;morphological identification;PCR detection;Henan region;layer-282023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023净；用1%锇酸固定1 h 30 min后使用针管抽吸锇酸，再次使用PBS清洗，直至将锇酸清洗干净；使用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇，各脱水置换15 min；再用100%乙醇脱水置换2次，每次不得少于20 min；再用100%丙醇脱水置换2次，每次不得少于20 min；使用丙酮 树脂（1 1）浸透螨虫1 h30 min；再次使用丙酮 树脂（1 2）浸透过夜；再将螨虫浸入醇树脂中放入硅胶板内过夜；进行聚合程序：37 12 h，45 12 h，60 24 h；70 nm超薄切片，捞片200目的带膜铜网；使用2%双氧醋酸铀染色20 min，用流动纯水清洗干净；再用2%柠檬酸铅染色10 min，充分清洗。1.6形态学鉴定在体视显微镜下观察玻片标本中螨虫的形态结构，记录躯体，螯肢、须肢、胸板、生殖腹板、肛板、腹肛板、刚毛、肛门等特点，比对文献中17-19的形态学特征，对其进行鉴定。1.718S rRNA基因PCR扩增将置于2 mL的离心管中的螨虫，利用QIAampDNA Mini Kit试剂盒在室温（1525）下按照说明书进行提取，完成后放置于-20 保存。参照刘成倩等20的鸡皮刺螨 18S rRNA 基因序列设计引物，引物序列为：F1为TAGGTGAACCTGCGGAAGGATC；R1为AGTTCAGCGGGTCGTCACTTG，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用KO