虎杖苷对非酒精性脂肪性肝细胞内质网应激的调控机制_王懿.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1虎杖苷对非酒精性脂肪性肝细胞内质网应激的调控机制王懿1，杨志勇2，李书芹3，陈卫香41上海健康医学院附属崇明医院核医学科，上海202150；2上海健康医学院附属崇明医院肿瘤科，上海202150；3上海健康医学院附属崇明医院血液科，上海202150；4上海健康医学院附属崇明医院全科，上海202150通讯作者：杨志勇，Email：论著【摘要】目的探讨虎杖苷对小鼠非酒精性脂肪肝疾病中肝脏细胞内质网应激、细胞自噬和凋亡的影响。方法采用高脂饮食诱导小鼠 NAFLD 疾病模型，对模型小鼠体质量进行监测，在造模结束后检测TG、LDL 和 ALT 等生化指标。体外培养 Huh7 细胞，用 PA 诱导细胞损伤。用 Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡，用蛋白质免疫印迹实验检测内质网应激标记分子 Bip、peIF2、CHOP、ATF6 和 pIRE1 的表达和自噬标记分子 LC3 和 p62 的表达；采用免疫荧光染色法检测 LC3 蛋白的定位。结果与对照组相比，灌胃小鼠高脂饮食条件下的体质量、TG 和 LDL 显著下降（P0.05）；虎杖苷处理组 HepG2 细胞 PA 诱导的细胞凋亡水平显著下降（P0.05）；内质网应激标记分子 Bip、peIF2、CHOP、ATF6 和 pIRE1 的表达水平显著下降（P0.05）；细胞自噬活性明显增加。结论虎杖苷通过抑制内质网应激和细胞自噬保护高脂诱导的肝损伤。【关键词】虎杖苷；非酒精性脂肪肝；内质网应激；凋亡；自噬基金项目：上海市崇明区“可持续发展科技创新行动计划”项目计划（CKY201918）DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.10Regulatory mechanism of Polygonidine on endoplasmic reticulum stress in nonalcoholic fatty hepatocytesWANG Yi1,YANG Zhiyong2,LI Shuqin3,CHEN Weixiang41Department of Nuclear Medicine,Chongming Hospital Affiliated to Shanghai Health Medical College,Shanghai202150，China;2Department of Oncology,Chongming Hospital Affiliated to Shanghai Health Medical College,Shanghai 202150，China;3Department of Hematology,Chongming Hospital Affiliated to Shanghai Health Medical College,Shanghai 202150，China;4Department of General Medicine,Chongming Hospital Affiliated to Shanghai Health Medical College,Shanghai 202150，ChinaCorresponding author：YANG Zhiyong，Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of polygonidine on endoplasmic reticulum stress，autophagy and apoptosis of liver cells in mice with nonalcoholic fatty liver disease.MethodsThe mouse model of NAFLDwas induced by highfat diet.The body weight of the model mice was monitored，and the biochemical indexes suchas TG，LDL and ALT were detected after the modeling.Huh7 cells were cultured in vitro and induced by PA.Annexin V/PI staining was used to detect cell apoptosis.Western blotting was used to detect the expression of endoplasmicreticulum stress markers Bip，PEIF2，CHOP，ATF6 and PIRE1，and the expression of autophagy markers LC3and P62.The localization of LC3 protein was detected by immunofluorescence staining.ResultsCompared with thecontrol group，the body weight，TG and LDL of mice treated with highfat diet were significantly decreased（P0.05）.The PAinduced apoptosis level of HepG2 cells in PD treated group was significantly decreased（P0.05）.The expressions of endoplasmic reticulum stress markers Bip，PEIF2，CHOP，ATF6 and PIRE1 were significantly decreased（P98%，MCE）、棕榈酸（palmitic acid，PA，SigmaAldrich），DMEM 培养 基、胎 牛 血 清（Gibco），细 胞 凋 亡 试 剂 盒（Yeasen），兔抗 Bip 抗体、兔抗 LC3 抗体、鼠抗CHOP 抗体、兔抗 PhosphoeIF2 抗体、兔抗 ATF6抗体（CST），兔抗 PhosphoIRE1 抗体（Abcam）、HRP 偶联二抗（碧云天生物科技）、FITC 偶联山羊抗兔抗体（Abcam），等。1.2方法1.2.1NAFLD小鼠模型18 只 C57BL/6 小鼠随机分为对照组、高脂饮食（HFD）组和HFD+PD组，每组 6 只。对照组饲喂正常饲料，HFD 组饲喂高脂饲料，HFD+PD 组每天按 100 mg/kg 剂量以灌胃形式给予虎杖苷干预。饲喂期间小鼠自由进水进食，并每天进行体质量监测。在饲喂8周后，采集小鼠心脏血，并制备血清，监测血清中TG、LDL 及ALT水平。1.2.2细胞培养及处理HepG2细胞分为对照组、PA 组和 PA+PD 组。PA 组培养基加入终浓度为0.2 mmol/L 的 PA，PA+PD 组在加入 0.2 mmol/L PA的同时加入终浓度为5 mg/L的PD。加药处理后，细胞继续放置在37 培养箱中培养24 h。1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡消化并离心收集各组细胞，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，调整细胞密度至 2106/mL。取 100 L 细胞悬液，首先加入100 L FITCAnnexin V 孵育液，4避光染色15 min，随后加入终浓度为1 g/mL的碘化丙啶（PI）染色液，使用 BD FACSCalibur 流式细胞仪同时检测荧光通道 1（FL1）和荧光通道 2（FL2）的荧光信号，以 Annexin V 阳性细胞为凋亡细胞，计算各组凋亡细胞比例。1.2.4蛋白质免疫印迹检测收集各组细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，冰上裂解 30 min，随后离心去除细胞碎片，取上清，用BCA 法定量蛋白浓度。加入 5SDS 上样缓冲液，100沸水浴加热 10 min，制备细胞总蛋白样品。使用浓度为 4%20%的 SDSPAGE 梯度凝胶电泳分离蛋白样品，随后将蛋白样品转印到 PVDF 膜上（电泳条件：室温，100V、10 mA；转膜条件：冰浴，100V、300 mA）。PVDF 膜用 5%脱脂奶粉封闭30 min，后浸泡在一抗孵育液中，4孵育过夜。经TBST 充分漂洗（3 次，每次 5 min），加入二抗孵育液，室温孵育 2 h。最后加入化学发光底物，利用凝胶成像仪获取蛋白条带。1.2.5免疫荧光染色制备 HepG2 细胞爬片，各组细胞加药处理后，弃掉培养基，用 PBS 漂洗 2次。随后加入 4%多聚甲醛溶液，室温固定 10min，再加入 0.1%Triton X100，室温孵育 15 min。细胞爬片用2%牛血清白蛋白溶液封闭30 min后，58解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1表1各组小鼠生化指标比较（MeanSD）组别对照组HFD组HFD+PD组n666TG（mmol/L）0.520.141.300.27*1.190.22*LDL（mmol/L）0.370.091.570.24*1.320.15*ALT（U/L）32.76.7375.849.5*204.123.2*#注：*与对照组比较，*P0.05；#与HFD组比较，#P0.05分别加入抗 LC3 抗体孵育液和 FITC 荧光二抗，各孵育 1 h。经 PBS 充分漂洗后，加入终浓度为 2mg/L的Hoechst 细胞核染色液孵育10 min，最后用封片剂封片，使用正置荧光显微镜获取图像。1.3统计学分析实验结果用均值 标准差（MeanSD）表示，使用 SPSS 21.0 统计软件进行分析，组间两两比较采用 t 检验，小鼠体质量变化数据比较采用双因素方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1虎杖苷对高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝疾病的影响2.1.1NAFLD模型小鼠体质量监测与正常饮食的对照组小鼠相比，HFD组小鼠体质量随饲喂时间的延长逐渐增加，在小鼠高脂饲喂56 d后，HFD组小鼠平均体质量达到37.4 g，而对照组小鼠平均体质量为 25.4 g。HFD+PD 组平均体质量为 33.2g，显著低于HFD组（P0.05）（图1）。2.1.2NAFLD模型小鼠生化指标与对照组小鼠相比，HFD组小鼠高脂饲喂56 d后，血清甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和转氨酶水平显著升高（均 P0.05）；ATL 水平则显著下降（P0.01），表明小鼠肝损伤减轻（表1）。2.2PD对FA诱导肝细胞凋亡的影响与对照组相比，FA 组 Huh7 细胞凋亡比例显著升高（P0.001），而与 FA 组相比，加入 5 mg/LPD的细胞（FA+PD组）凋亡细胞比例显著下降（P0.01）（图2）。图 1各组小鼠体质量变化曲线*与对照组比较，*P0.05；#与HFD组比较，#P0.05014284256饲喂时间（d）403530252015小鼠体重（g）对照组HFD组HFD+PD 组*#图2各组细胞凋亡比例*与对照组比较，*P0.05；#与PA组比较，#P0.05；n=31086420凋亡细胞（%）对照组*#PA组PA+PD组对照组PA组PA+PD组0.741%0.059%99.1%0.059%1.94%7.80%89.5%0.790%0.393%1.53%95.4%2.70%100101102103104FL1H104103102101100FL2H100101102103104FL1H100101102103104FL1H104103102101100FL2H104103102101100FL2H2.3PD对PA诱导的内质网应激的影响饱和脂肪酸如 PA 会引发未折叠蛋白反应（UPR）及内质网应激。与对照组相比，PA 组细胞UPR标记分子Bip表达水平显著上调（P0.01），内质