海洋生境间苯三酚高产菌株选育及其培养基优化_马湘君.pdf

第4 5卷 第1期2 0 2 3年 2月海 洋 湖 沼 通 报T r a n s a c t i o n so fO c e a n o l o g ya n dL i m n o l o g yV o l.4 5 1F e b.,2 0 2 3海洋生境间苯三酚高产菌株选育及其培养基优化马湘君1,2,王祥法1,侯仕营1,2,李银塔1*,田 黎3(1.威海海洋职业学院,山东 荣成2 6 4 3 0 0;2.山东省海洋经济藻类资源开发与利用工程技术协同创新中心,山东 荣成2 6 4 3 0 0;3.自然资源部第一海洋研究所,山东 青岛2 6 6 1 0 0)摘 要:本研究以一株分离筛选到的产间苯三酚的海洋生境假单胞菌L B F-9 6为基础,通过传统紫外诱变以及紫外微波复合诱变选育间苯三酚高产菌株,并采用响应曲面法优化突变株的发酵培养基。结果显示:经紫外照射6 0s、微波辐照2 0s复合诱变获得了一株间苯三酚高产菌Y LM 9 6-0 1,利用肉桂醛显色法测得其间苯三酚产量为0.5 9 9g/L,较原始菌株提高了1 5 9%,且产间苯三酚时间提前,降低了发酵培养的成本;经传代培养显示突变株Y LM 9 6-0 1具有良好的遗传稳定性。采用响应曲面法优化培养条件后,突变株Y LM 9 6-0 1间苯三酚的产量提高为0.7 8 4g/L,比优化前提高3 1%。通过紫外微波复合诱变选育出的间苯三酚高产菌Y LM 9 6-0 1,具有潜在生产应用价值。关键词:间苯三酚;假单胞菌;紫外微波复合诱变;响应面法中图分类号:Q 9 3 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 3-6 4 8 2(2 0 2 3)0 1-0 6 7-0 7D O I:1 0.1 3 9 8 4/j.c n k i.c n 3 7-1 1 4 1.2 0 2 3.0 1.0 1 0引 言间苯三酚是一种应用广泛的大宗化学品,同时也是食品添加剂、化妆品和药物的通用前体,在国内外市场需求广阔1-3。化学合成法产间苯三酚存在环境污染等弊端,环境友好型的生物合成法广受关注4。例如A c h k a r等在大肠杆菌中导入合成间苯三酚的关键基因p h l D,使表达的间苯三酚产物产量达到7 8 0m g/L5;赵广等研究利用乙醇生产间苯三酚的重组菌的构建,实验菌株间苯三酚产量为0.3 8g/L6。本研究以筛选获得的一株产间苯三酚的芸薹假单胞菌(P s e u d o m o n a s b r a s s i c a c e a r u m)L B F-9 6为基础,其在G e n B a n k数据库中序列登录号为MT 0 3 9 6 3 7,利用紫外和紫外微波复合诱变育种来提高菌体间苯三酚的产量。紫外诱变育种是利用紫外线可直接作用于细菌D NA,阻碍碱基的正常配对,造成基因突变,提高筛选效率7-8。微波诱变作为一种非电离电磁辐射物理诱变育种技术,在提高药源微生物产量和拓展活性菌株新资源等方面具备较好前景,可减少突变率低、突变谱窄等弊端9。响应曲面法是微生物领域比较常用的实验设计方法,采用此法对各因素交互作用进行评价,可利用较少试验组数据确定最佳水平范围1 0。如何伟等通过对高效表达淀粉酶B a c i l l u sk o r e e n s i s的培养基进行响应面优化,其优化后菌株的淀粉酶活力比未优化前提高了6 9.7 6%1 1。王晓洁等通过响应面法优化侧孢短芽孢杆菌产短杆菌素发酵培养基,菌株短杆菌素含量较优化前提高了3 4.6%1 2。本研究运用响应面法,在单因素实验的基础上,考察蛋白胨、甘油、葡萄糖三种培养基组分对间苯三酚产量的影响,优化了突变株的发酵条件,为间苯三酚的生物合成提供了新的微生物资源与参考资料。1 材料与方法 基金项目:山东省海洋经济藻类资源开发与利用工程技术协同创新中心科研开放基金项目(MA D U2 0 2 0 0 1;MA D U 2 0 2 1 0 0 0 1);获威海海洋职业学院水产养殖技术高水平专业群项目资金支持;2 0 2 0年山东省职业教育技艺技能传承创新平台建设计划(9 6);潍坊市2 0 2 1年科技发展计划项目(2 0 2 1 G X 0 2 6)第一作者简介:马湘君(1 9 9 0),女,硕士,讲师,山东潍坊人,主要从事微生物育种及发酵研究。E-m a i l:9 9 3 9 1 7 5 2 8 q q.c o m*通信作者:李银塔(1 9 8 0),男,博士,教授,山东滨州人,从事活性物质提取的研究。E-m a i l:l i y i n t a 1 2 31 6 3.c o m 收稿日期:2 0 2 2-1 0-2 96 8 海 洋 湖 沼 通 报2023年1.1 材料1.1.1 菌株诱变选育中供试菌为前期筛选得到的一株芸薹假单胞菌,编号为L B F-9 6。1.1.2 培养基改良的K B培养基:琼脂1 8g,蛋白胨1 0g,甘油1 0m L,葡萄糖5g,酵母粉2g,人工海水配制至1L,调p H7.2。1.1.3 仪器与试剂微波炉(P J 2 1 C-AN)广东美的微波炉制造有限公司;肉桂醛购自青岛群昌科贸有限公司,其它试剂购自国药集团化学试剂有限公司。1.2 方法1.2.1 诱变方法1)菌株L B F-9 6的紫外诱变操作取2 8、1 5 0r/m i n培养4 8h的L B F-9 6菌悬液离心收集菌体,无菌生理盐水离心洗涤两次后制成菌悬液,镜检并稀释至1 08C F U/m L左右1 3;开1 5W紫外灯预热2 0m i n,预热结束后,向无菌培养皿内加入上一步制备好的菌悬液5m L,培养皿放置于磁力搅拌器上,位于紫外灯正下方3 0c m处,将一灭过菌的磁子放入,在搅拌下分别照射3 0、6 0、9 0、1 2 0s。所有操作应避免白炽光1 4;取照射后菌悬液0.1m L稀释涂平板,未照射菌悬液作为对照,2 8下避光培养7 2h后,计算各照射时间下的致死率。2)菌株L B F-9 6的紫外微波复合诱变先以1 5W紫外灯照射诱变3 0、6 0或9 0s,再于微波炉(输出功率:8 0 0 W;脉冲频率:2 4 5 0MH z)内辐照诱变1 0s或2 0s。微波诱变为消除辐照热效应,采取辐照5s后冷水浴冷却2 0s的方式1 5。3)诱变效果评价方法选取菌株死亡率和正突变率为评价诱变效果的指标,其计算方法为:菌株致死率=(A-B)/A1 0 0%(1)菌株正突变率=X/C1 0 0%(2)其中,A为未经诱变处理菌落数;B为经诱变处理菌落数;X为相对效价大于1 0 0%的菌落数;C为突变菌落数。1.2.2 产物间苯三酚的检测以肉桂醛显色法1 6对突变株发酵产物进行检测。1.2.3 突变株的稳定性测试将Y LM 9 6-0 1接种于1 0 0m L的改良K B液体培养基中,于2 8,1 5 0r/m i n摇床培养7 2h,累计传代培养五代,检测每一代菌株产物间苯三酚的量并记录。表1 响应面试验设计因素与水平T a b l e1 D e s i g nf a c t o r sa n d l e v e l so f r e s p o n s es u r f a c e t e s t因素编码水平-101蛋白胨/(g/L)A2.5 08.0 01 3.5 0葡萄糖/(g/L)B2.5 06.2 51 0.0 0甘油/(m L/L)C2.0 04.7 57.5 01.2.4 响应面试验设计为系统研究间苯三酚产量与培养基成分之间的关系,在单因素试验基础上选取蛋白胨、葡萄糖、甘油三个因素设计响应面试验,以间苯三酚产量为指标,采用三因素三水平的B o x-B e h n k e n试验模型,具体因素与水平设置见表1。1.2.5 L B F-9 6与Y LM 9 6-0 1的间苯三酚产量曲线测定将对照菌株L B F-9 6和突变株Y LM 9 6-0 1分别接种于5 0m L优化后的液体培养基中,2 8,1 5 0r/m i n培养2 4h后作为种子液备用。将L B F-9 6和Y LM 9 6-0 1按1 0%接种量分别接种至1 5 0m L优化后的 液体培养基,于2 8、1 5 0 r/m i n下摇瓶发酵培养,每隔1 2 h分别测量菌株L B F-9 6与Y LM9 6-0 1的1期海洋生境间苯三酚高产菌株选育及其培养基优化6 9 表2 紫外诱变下菌株L B F-9 6的死亡率及正突变率T a b l e2 M o r t a l i t ya n dp o s i t i v em u t a t i o nr a t eo fs t r a i nL B F-9 6i n d u c e db yUV紫外诱变剂量/(1 5W,3 0c m)s死亡率/%菌株的正突变率 /%UV3 03 51.3 0 20.10.0 2 8UV6 07 04.1 8 01.20.1 3 4UV9 09 0以上0.50.0 9 5UV1 2 09 9以上0O D6 0 0和O D4 4 6的值,记录菌体生长量和产物间苯三酚积累量随时间的变化。2 结果2.1 紫外诱变将L B F-9 6分别紫外诱变3 0、6 0、9 0、1 2 0s后,诱变结果如表2所示,由结果可知,在距离1 5W紫外灯3 0c m处照射诱变6 0s时,L B F-9 6的菌体正突变率最高为1.2%,其诱变死亡率在7 0%。2.2 紫外微波复合诱变对L B F-9 6采取先紫外后微波的复合诱变,以诱变后菌株的死亡率和菌体间苯三酚产量的正突变率来确定最适紫外微波复合诱变时间。结果如表3所示。在距离1 5W紫外灯3 0c m处照射6 0s,微波再辐照1 0s的情况下,菌株间苯三酚产量的正突变率最高为1.8%,但实验中间苯三酚高产株却是在先紫外照射6 0s后微波辐照2 0s的条件下获得的。表3 紫外微波复合诱变下菌株L B F-9 6的死亡率及正突变率T a b l e3 M o r t a l i t ya n dp o s i t i v em u t a t i o nr a t eo f s t r a i nL B F-9 6u n d e rUV-m i c r o w a v ec o m b i n e dm u t a g e n e s i s紫外诱变剂量/(1 5W,3 0c m)s微波诱变剂量/s死亡率/%菌株的正突变率/%UV3 01 04 52.0 4 30.90.1 3 2UV3 02 06 03.8 1 41.30.2 1 6UV6 01 08 05.1 6 91.80.4 1 5UV6 02 09 52.6 1 20.30.0 6 4UV9 01 09 9以上0.20.0 5 4图1 间苯三酚浓度与O D4 4 6吸光度值的标准曲线F i g.1 S t a n d a r dc u r v eo fp h l o r o g l u c i n o l c o n c e n t r a t i o na n dO D4 4 6a b s o r b a n c ev a l u e2.3 突变株间苯三酚产量的测定配制不同浓度的间苯三酚标准液,分光光度法测其在O D4 4 6处的吸收值,以间苯三酚浓度为横坐标,O D4 4 6吸光度值为纵坐标,绘制间苯三酚浓度与吸光度之间的标准曲线。由图1可知,间苯三酚浓度与O D4 4 6吸光度值的标准曲线为:y=0.7 1 9x+0.1 3 1,式中,y:O D4 4 6吸光度值;x:间苯三酚浓度(g/L)。由此计算得出发菌株L B F-9 6间苯三酚产量最高值为0.2 3 1g/L,经紫外微波复 合 诱 变 后,筛 选 获 得 的 间 苯 三 酚 高 产 突 变 株Y LM 9 6-0 1,其间苯三酚产量的最高值为0.5 9 9g/L,相较原始菌株提高了1 5 9%。2.4 间苯三酚高产株Y LM 9 6-0 1的稳定性测试对诱变后的间苯三酚高产株Y LM 9 6-0 1进行传代培养,每代菌株至少做5