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动物细胞工程动物细胞工程 应用应用 动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 核移植核移植 动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术 皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？人耳鼠 人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？一、动物细胞培养一、动物细胞培养 1.1.发展历史发展历史:2020世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。争论。19071907年，美国生物学家哈里森年，美国生物学家哈里森(Harrison)(Harrison)从蝌从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。2、动物细胞培养的应用和概念：、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培动物细胞培养就是从动物有养就是从动物有机体中取出相关机体中取出相关的组织的组织,将它分散将它分散成单个细胞成单个细胞,然后然后,放在适宜的培养放在适宜的培养基中基中,让这些细胞让这些细胞生长和增殖生长和增殖.动物细胞的培养过程动物细胞的培养过程 幼龄动物 取动物器官 和组织 剪碎组织 胰蛋白酶处理 细胞培养养 单个细胞 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础 剪碎组织剪碎组织的目的？的目的？胰蛋白酶处胰蛋白酶处理的目的？理的目的？3、动物细胞培养过程：、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官 细胞悬浮液细胞悬浮液 胰蛋白酶胰蛋白酶 10代细胞代细胞 原代培养原代培养 50代细胞代细胞 传代培养传代培养 细胞株细胞株 无限传代无限传代 细胞系细胞系 单个细胞单个细胞 加培养液加培养液 遗传物质遗传物质未改变未改变 遗传物质遗传物质已改变已改变 动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）有关概念有关概念 原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）原代细胞。（分装前的细胞培养）传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念有关概念 细胞株：细胞株：传代培养的细胞一般传至传代培养的细胞一般传至10代左代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至50代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。动物组织细胞培养要求动物组织细胞培养要求 一一 体外培养特点体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。求更高。二二 培养工具培养工具:培养瓶、培养皿、培培养瓶、培养皿、培养管、养管、多孔培养板多孔培养板等。等。细胞培养以玻璃器皿为主。细胞培养以玻璃器皿为主。器皿应选择透明度好、无毒、器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。中性硬度玻璃制品。根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。三三、培养条件培养条件 细胞在体外培养中所需的条件 与体内细胞基本相同。【讨论讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。提示：无菌、无毒的环境。1）恒定的温度恒定的温度:37，维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为体细胞培养的标准温度为36.536.50.50.5，偏离这一温度，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过3939时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；人体细胞在人体细胞在3939-401401小时，即能受到一定损伤，但仍有可小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；能恢复；在在4040-411411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；恢复；4141-421421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；别细胞仍有恢复可能；当温度在当温度在4343以上以上1 1小时，细胞全部死亡。低温下会使细小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低胞代谢速率降低 2）PHPH：7.27.2-7.7.当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的生长会受到影响，时的生长会受到影响，甚至死亡。甚至死亡。用来检测PH的变化：红色-pH7.4，橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。3)气体：气体：有调节有调节PH的作用。的作用。气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。4）营养）营养培养基：培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培养在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。生长。动物细胞的培养基一般分为天然、合动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。还需要一些常用的溶液。合成合成培养基培养基 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。最普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培养基，如人工合成培养基，如109培养液、培养液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。培养液等。天然天然培养基培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。生物学性状不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为牛血清分为胎牛血清和犊牛血清胎牛血清和犊牛血清，前者来，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。白质主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有氨基酸中有1212种是细胞本身不合成的，种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)(MSA)、类胰岛素生长因子、类胰岛素生