细胞分离与培养技术.ppt

1 临床药理研究所临床药理研究所 2 现代生物技术现代生物技术 基因工程技术基因工程技术 细胞工程技术细胞工程技术 酶工程技术酶工程技术 发酵工程技术发酵工程技术 细胞培养细胞培养 3 细胞分离技术细胞分离技术 从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞 从原培养容器中分离细胞从原培养容器中分离细胞 -传代培养传代培养 原代培养原代培养 4 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 采血方法：采血方法：人人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；小动物（大鼠、小鼠）小动物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。断颈取血或股动脉放血。兔兔 耳静脉或动脉穿刺取血。耳静脉或动脉穿刺取血。5 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 血液抗凝方法：血液抗凝方法：肝素法肝素法：按每：按每mlml血液约用血液约用0.10.1-0.2mg0.2mg肝素（即肝素（即5%5%肝素溶液肝素溶液2 2-4 4 l l）；）；草酸盐法：草酸盐法：取草酸钾取草酸钾0.2g0.2g，草酸铵，草酸铵0.3g0.3g，加双蒸水，加双蒸水10ml10ml溶解后，取溶解后，取0.2ml0.2ml放入放入5ml5ml的试管中，使其干燥。若采用的试管中，使其干燥。若采用5ml5ml以下的血液可直接注以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃；入此试管中，轻轻摇晃；枸橼酸钠法：枸橼酸钠法：先配制先配制2%2%枸橼酸钠，取枸橼酸钠，取0.150.15-0.2ml0.2ml加于加于1ml1ml血液中即可血液中即可抗凝；抗凝；EDTAEDTA法法（186.1186.1）：每）：每mlml血液中加血液中加0.5mmol/L EDTA 20.5mmol/L EDTA 2l l。6 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 体液标本采集：体液标本采集：在局部在局部70%70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。膝关节腔穿刺膝关节腔穿刺 胸腔穿刺胸腔穿刺 7 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 血样中红细胞和白细胞的分离：血样中红细胞和白细胞的分离：利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。抗凝血，室温或抗凝血，室温或3737下直立静置下直立静置3030-60min60min，红细胞沉降至下层，中，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与与3%3%明胶（经灭菌消毒）等量或明胶（经灭菌消毒）等量或3 3l l量混合于离心管中，直立静置量混合于离心管中，直立静置3030-60min60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。8 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 血中单个核细胞的分离：血中单个核细胞的分离：单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.0501.050-1.0771.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。之间，采用速度沉降法原理使其分离。淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 9 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 血中单核细胞的分离：血中单核细胞的分离：利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离 单单个个核核细细胞胞悬悬液液 多将悬液放入多将悬液放入12cm12cm直径的培养直径的培养皿中，于皿中，于3737培养箱中静置培养箱中静置3030-60min60min。此时单核细胞贴壁，而。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用壁细胞，并用HanksHanks液轻轻冲洗液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下培养皿以尽量洗下未贴壁细胞未贴壁细胞（淋巴细胞）。（淋巴细胞）。用用Hanks液强液强力冲洗吹打与力冲洗吹打与震荡，将贴壁震荡，将贴壁的单核细胞冲的单核细胞冲落或用刮刀轻落或用刮刀轻刮，收集刮，收集贴壁贴壁的单核细胞的单核细胞。计数后计数后分别制分别制备所需备所需浓度的浓度的细胞悬细胞悬液。液。10 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 黏附法分离血中单核细胞、黏附法分离血中单核细胞、T T，B B淋巴细胞淋巴细胞 因因B B淋巴细胞和单核细胞能黏附于淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与所以可将其与T T淋巴细胞分离。淋巴细胞分离。11 具体步骤：具体步骤：单个核细胞用含单个核细胞用含20%20%小牛血清小牛血清RPMIRPMI-16401640制成（制成（2.52.5-3 3）10107 7/ml/ml的细的细胞悬液。胞悬液。先用先用HanksHanks液，再用含液，再用含20%20%小牛血清的小牛血清的RPMIRPMI-16401640液冲洗平衡尼龙纤维液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。柱，冲洗液尽量流净。将尼龙柱预温将尼龙柱预温3737，再用配制的单个核细胞悬液，再用配制的单个核细胞悬液2ml2ml装入尼龙纤维柱，装入尼龙纤维柱，不使流出，不使流出，3737温箱内静置温箱内静置l l小时。小时。取下注射针头，用预温取下注射针头，用预温3737含含20%20%小牛血清的小牛血清的RPM IRPM I-16401640培养液冲洗培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T T淋巴细胞。淋巴细胞。从注射器内取出尼龙纤维，在从注射器内取出尼龙纤维，在44的的RPMIRPMI-16401640液内漂洗，并轻轻挤压，液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的将黏附的B B细胞洗脱收集（细胞洗脱收集（B B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。其分离）。收集的收集的T T、B B淋巴细胞可分别用淋巴细胞可分别用HanksHanks液悬浮，洗涤，离心（液悬浮，洗涤，离心（250g250g，7min7min），并重复洗涤），并重复洗涤3 3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的所需浓度的T T和和B B淋巴细胞悬液。淋巴细胞悬液。12 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)(MACS)分离分离T T、B B淋巴细胞：淋巴细胞：磁性微珠是磁性微珠是2020世纪世纪8080年代初以高分子材料和金属离子（如年代初以高分子材料和金属离子（如FeFe3 3O O4 4）为原料聚合而成的一种以为原料聚合而成的一种以金属离子为核心金属离子为核心、外层均匀地包裹、外层均匀地包裹高分子聚合高分子聚合体体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。即可制成免疫磁性微珠。13 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 免疫磁性微珠免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。分离的目的。通常有二种分离方式：通常有二种分离方式：阳性分离阳性分离和和阴性分离阴性分离。阳性分离是直接从细胞。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。得以分离。14 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞、造血祖细胞(CD34)、单核、单核/巨噬细巨噬细胞胞(CD14)、胰岛细胞、胰岛细胞(胰岛胰岛GK和和GLUT2（葡萄糖转运子）（葡萄糖转运子）)、多种肿瘤、多种肿瘤细胞等。细胞等。15 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 16 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 17 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 18 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 MACS技术优点技术优点：稳定、高质量的分选稳定、高质量的分选：纯度（：纯度（90-99%）对细胞无损伤对细胞无损伤 操作简便、快速：操作简便、快速：消毒方便，手动分选消毒方便，手动分选30分钟内分钟内完成，完成，autoMACS分选分选2.5-10分钟之内完成。分钟之内完成。从实验室到临床：从实验室到临床：MACS技术可以实现技术可以实现105-1011个个细胞分选。有细胞分选。有autoMACS和和CliniMACS。分选后细胞适用于后续实验：分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。组分均可回收利用。从细胞到分子分选：从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及及mRNA。MACS技术缺点：技术缺点：分离效率较流式细胞仪分分离效率较流式细胞仪分选略低选略低 且耗材相对较贵，适合无且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。选细胞纯度要求不高的分选。只适用于简单标记的细胞只适用于简单标记的细胞分离分离 19 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 流式细胞术分离法分离流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：淋巴细胞：密度梯度离心法分离单个核细胞，用密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成培养基配成1107/ml；加适量加适量FITC-抗抗CD3或或FITC-抗抗CD19，4孵育孵育30min,用用RPMI-1640培养基洗培养基洗2次；次；用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。20 细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞 注意事项：注意事项：分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。此法