踝关节扭伤小鼠模型的构建研究_张凯.pdf

摘要：本文构建了一种操作简便、能较好地模拟运动型踝关节扭伤临床症状，并适用于治疗扭伤药物开发使用的小鼠模型。在模型建立后，实验评估造模及给药恢复情况。平衡木试验、步态分析、足宽及白细胞介素-1含量的测试结果表明，与正常组比模型组及阳性药组指标在造模后有显著变化（P 0.05），且药物可以加速模型动物的恢复。此外，组织形态学和病理学观察亦验证了此结果。因此，该方法可成功地形成小鼠踝关节扭伤模型，适用于扭伤类药物开发相关研究。关键词：小鼠；动物模型；踝关节扭伤；白介素1中图分类号：R945文献标志码：A文章编号：2096-854X（2022）060078-04Construction of Mouse Model of Ankle SprainZhang Kai1，Fan Yawen1，Zhou Liangliang1，Li Wei2，Chen Zhenhua1，*，Guan Zheng1，*（1.School of Pharmacy,Jiangxi Science and Technology Normal University,Nanchang 330013,P.R.China;2.School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310058,Zhejiang,P.R.China）Abstract:In this study,an ankle sprain mouse model,which is easy to operate and can better simulate the clinicalsymptoms of athletic ankle sprain,has been constructed for drug development.After the model has been established,the recovery of the model and the drug administration was also evaluated.The results of the balance beam test,gaitanalysis,foot breadth,and interleukin-1（IL-1）content suggested that after the mouse model had been established,compared to the control,the model and the positive drug groups were significant different from the control（P 0.05）,and the drug can speed the recovery of the model.In addition,the histomorphological and pathological studies has alsosupported the finding.Therefore,the method can successfully form the ankle sprain model in mice,which is applicablefor drug development.Key words:Mouse;animal model;ankle sprain;?interleukin-1踝关节扭伤小鼠模型的构建研究张凯1，范雅雯1，周良良1，李巍2，陈振华1，*，管政1，*（1.江西科技师范大学药学院，江西 南昌，330013；2.浙江大学医学院，浙江 杭州，310058）【生物医药】收稿日期：2022-03-04最终修回日期：2022-08-08接受日期：2022-08-08基金项目：江西省自然科学基金青年基金（20202BABL216026）、江西科技师范大学博士启动基金（2019BSQD015）作者简介：张凯，男，在读硕士研究生，研究方向：药物制剂；范雅雯，女，在读本科生；周良良，男，讲师，博士，研究方向：药理病理及其机制；李巍，女，高级实验师，硕士，研究方向：动物疾病模型构建与病理机制；*陈振华（第一通讯作者），男，教授，博士，研究方向：药物新剂型及质量评价，E-mail:；*管政（第二通讯作者），女，讲师，博士，研究方向：中药新产品开发，E-mail:z_。江西科技师范大学学报Journal of Jiangxi Science&Technology Normal University第6期Issue 62022年12月Dec.20221前言踝关节扭伤是日常生活、运动、劳动及军事活动中最常见的疾病之一1。目前，药理研究采用的踝关节扭伤造模方法可分为手术造模2-5和非手术造模。手术造模常采用切断韧带的方法，耗时较长、给药后不易恢复。非手术造模则主要采用关节腔注射6和关节制动等方法7。但关节腔注射在小鼠模型中常难以2022年控制给药剂量8，而关节制动则未见有小鼠模型相关报道。考虑手术及关节腔注射造模机理与运动性扭伤病生理过程相差较远，小鼠软骨和踝关节在构造上与人体有高度相似性9，本研究采用成本低、喂饲操作便捷的小鼠作为模型动物，改良关节制动法以模拟临床运动性踝关节扭伤。同时，将模型给药定期可恢复纳入评价标准，采用红花油作为阳性药辅助判断造模程度，旨在为踝关节扭伤相关研究，尤其是新药临床前药理研究提供更为方便有效的研究工具。2材料与方法2.1实验材料与仪器昆明（KM，Kunming）小鼠30只，雄性，体重为205 g，江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXX（赣）20180003。动物蜡笔（郑州智牧人机械设备有限公司）、戊巴比妥（德国默克公司）、小鼠白细胞介素-1（IL-1，interleukin-1）酶联免疫试剂盒（江西艾博因生物科技有限公司，批号：IB-E20531）、正红花油（华仁堂药业公司）、生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）、脱毛膏（南京亿迅生物科技有限公司）、10%福尔马林中性固定液（南昌雨露实验器材有限公司）。SF-400型电子秤（深圳市海浩电子科技有限公司）、直径4cm平衡圆木（天台木吉工艺品厂）、U型透明亚克力通道（上海逸哲精密器械有限公司）、Multiskan Sky型全自动酶标比色仪（赛默飞世尔上海仪器有限公司）、DM9型工业显微镜（深圳市舒安科技发展有限公司）、ES-44-SC型光学显微镜（深圳市达泰森贸易有限公司）。2.2分组与模型构建小鼠随机均分为正常组、模型组和阳性药组（n=10）。动物禁食12 h后，麻醉造模。首先，将小鼠左后足由正常位置向内翻180、足底屈曲1806，100次/min连续翻折4 min。随后使用自制圆筒对准小鼠左后踝关节，将质量为400 g的金属块从圆筒内10 cm高处自上而下垂直落下冲击关节，手触无骨折及脱位10。造模次日，阳性药组涂抹给药（正红花油），其余组涂抹生理盐水对照，每日3次，连续5天。2.3模型评价2.3.1平衡木实验采集造模前一日及造模次日起连续五天的平衡木数据。实验时，平衡木与地面成15夹角，装置一端与暗盒开口处相接。小鼠通过平衡木的距离为60 cm。每次实验，每只小鼠通过6次。记录并计算每只小鼠平均通过时间和踩空跌落次数11。2.3.2步态分析采集造模前一日及造模次日起连续五天的步态数据。实验时，将小鼠前、后足染色，小鼠通过通道后留下足印。除去第一步和最后一步足印，选取较清晰的连续三步用于步态分析。足印重叠偏倚程度12等于右侧平均足印重叠距离/左侧平均足印重叠距离。测量同一步中前足和后足中心点之间的距离，若前足和后足的足印重叠，则记为0。2.3.3足宽测量测量造模前一日、造模当日、造模次日起第六日小鼠的左后足宽度。在工业显微镜下，以第一指骨、第五指骨与掌骨连接端为两端，两端相连，建立横轴。在足两侧做标线，两标线间距离为足宽。2.3.4踝关节连接面观察在造模次日起第六日处死小鼠，取左后肢，清除踝关节周围软组织，进行胫、跖骨分离。在工业显微镜下观察并拍照。观察内容有：光滑度及光泽，是否有裂痕、缺损、糜烂及骨赘13。2.3.5 IL-1含量测定血清：取全血静置2 h，3000 r/min离心10 min，收集血清，20保存备用。软骨组织：剔取踝关节软骨组织，研磨后用生理盐水按1:12稀释，涡旋1 min，3000 r/min离心10min，收集上层清液14，20保存备用。IL-1含量测定按试剂盒说明书操作。酶标仪测得样本光密度（OD，optical density）值后计算浓度。2.3.6病理切片15将小鼠左后肢样本置于10%福尔马林中固定。张凯，范雅雯，周良良，等：踝关节扭伤小鼠模型的构建研究79江西科技师范大学学报第6期随后进行脱钙、清洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、烘片、苏木精-伊红（HE，hematoxylineosin）染色、脱水、透明、封固等步骤制作病理切片。显微镜下观察，拍照分析。3结果与分析3.1平衡木实验平衡木实验结果（图1）表明，造模后模型组及阳性药组小鼠通过平衡木的时间及跌落次数均显著增加（P 0.01，P 0.01）；随着给药时间增加，阳性药组在给药第五日动物通过平衡木的时间及跌落次数均较模型组少（P 0.01，P 0.05），体现出了较好的给药效果。图1小鼠平衡木测试（D0，D2-D6分别表示造模前一天，造模后给药一到五天.造模组与正常组比较，#P 0.05，#P 0.01；阳性药组与正常组比较，*P 0.05，*P 0.01；阳性药组与造模组比较，P 0.05，P 0.01）3.2步态分析步态分析结果（表1）表明，各组在造模前无显著性差异；造模次日起，模型组及阳性药组与正常组比均有显著差异（P 0.05）；给药第二日起造模组与阳性药组有差异，但没有显著性。推测这可能和给药频率较低、给药时间较短有关。3.3足宽测量在以足宽代表动物足趾肿胀度的实验中，三组动物间的足宽（表2）在造模前均无显著性差异；造模完成后当天，模型组及阳性药组和正常组比均有明显肿胀（P 0.01）；但阳性药组的足趾肿胀情况并未随着给药而消失。同“步态分析”部分，推测这可能和给药频率较低、给药时间较短有关。表2小鼠的足宽（XS，n=10）注：D0、D1、D6分别表示造模前1天、造模当天、造模第6天。造模组与正常组比较，#P 0.05，#P 0.01；阳性药组与正常组比较，*P 0.05，*P 0.01。3.4形态学观察根据图2观察可见，正常组的胫骨关节面、胫骨内侧髁、胫骨外侧髁均平滑，有光泽，无缺损及糜烂；造模组的胫骨关节面、胫骨外侧髁出现了较大的缺损，侵及深层，有骨赘形成；阳性药组的胫骨关节面则稍显粗糙，胫骨内侧髁软骨表面出现缺损，极少部分关节面见轻微糜烂，软骨出现较小缺损，侵及中层。因此，各组关节损伤情况在形态学上存在肉眼基本可分辨的差异性特征。图2踝关节连接面的形态3.5IL-1含量IL-1检测结果（表3）表明，小鼠血清中IL-1含量很低且三组动物间无显著性差异，表明造模程度较合适、未引起过于严重的炎症反应。同时，与正常组比，造模组软骨组织中IL-1水平极显著的（P 0.01）高于正常组，表明造模能有效诱发关节炎症反应；阳性药组IL-1水平介于正常组与模型组之间，认为该动物模型造模程度适中，IL-1指标能较灵敏的反映给药效果。时间正常组（cm）模型组（cm）阳性药对照组（cm）D0D2D3D4D5D61.0620.1961.0560.1901.0410.1331.0170.0561.0550.1331.0110.0481.0250.2101.8400.296#2.4911.188#2.1580.689#1.9540.850#1.3310.141#1.0540.1542.5331.000*1.9410.633*1.7110.524*1.2750.200*1.2800.177*表1小鼠步态分析（XS，n=10）注：D0、D2-D6分别表示造模前一天、造模后给药第一天到第五天。