红毛藻不同乙醇浓度提取物的生物活性及其成分分析_常高萍.pdf

化学试剂 第 卷第 期红毛藻不同乙醇浓度提取物的生物活性及其成分分析常高萍，林巧燕，张敏，郭佳瑄，李志朋，杜希萍，姜泽东，（集美大学 海洋食品与生物工程学院，福建 厦门；福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门；厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建 厦门；厦门南方海洋研究中心海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建 厦门）收稿日期：；网络首发日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；福建省自然科学基金项目（）。作者简介：常高萍（），女，河南开封人，硕士生，主要研究方向为生物化学与分子生物学。通讯作者：李志朋，：。引用本文：常高萍，林巧燕，张敏，等红毛藻不同乙醇浓度提取物的生物活性及其成分分析化学试剂，（）：。摘要：为了探究红毛藻乙醇提取物活性成分及其功能活性，使用不同浓度乙醇溶液提取红毛藻，并测定不同浓度乙醇溶液提取物中的总多酚、总生物碱、总黄酮含量。通过研究胰脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶抑制活性和 自由基清除能力来评价不同浓度乙醇溶液提取红毛藻的活性差异。通过 技术完成红毛藻乙醇提取物中的多酚鉴定。结果表明，红毛藻不同乙醇浓度提取物均具有 清除能力以及酪氨酸酶、胰脂肪酶、乙酰胆碱酯酶抑制活性，乙醇浓度不同，其提取物生物活性不同，总多酚、总黄酮、总生物碱含量不同；其中 乙醇浓度提取物总多酚、总黄酮和总生物碱含量最高，具有较强的 清除能力和酪氨酸酶抑制活性。同时结果还表明，总多酚和总黄酮含量与酪氨酸酶抑制活性和 清除能力均具有极显著相关性。结果显示红毛藻 乙醇提取物中含有 种多酚类化合物。关键词：红毛藻；生物活性；成分分析；相关性分析；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，；，；，）：，：；红毛藻（）又称红毛菜、红毛苔等，是一种重要的商业食用红藻，在中国广泛分布于东南海沿岸，其中福建省莆田市是主要产地之一。红毛藻不仅味道鲜美，含有丰富的营养成分，还具有降血压和防止心血管疾病等作用。但目前国内外对红毛藻的研究多集中在红毛藻多糖、藻红蛋白及其生理学特性，如宋田源等通过提取分离红毛藻多糖得到多糖组分 对血管紧张素转换酶活性具有显著抑制作用，其半数抑制浓度 为.，具有潜在的降血压第 卷第 期常高萍等：红毛藻不同乙醇浓度提取物的生物活性及其成分分析功效；付晓苹纯化得到的红毛藻藻红蛋白具有抗氧化活性，其对羟基自由基的半数清除率为.，对过氧化氢的半数清除率为.。而关于红毛藻小分子活性成分与生物活性之间相关性的研究却很少报道。如 等研究发现红毛藻 乙醇提取物具有保湿和美白作用；李月等研究结果表明，采用乙醇提取的红毛藻多酚提取物具有 和 自由基清除能力。本文使用不同浓度乙醇溶液提取红毛藻中的小分子活性物质，并对提取物中总多酚、总黄酮、总生物碱含量与 清除能力、胰脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶抑制活性进行相关性分析。进一步基于 技术分析红毛藻乙醇提取物中总多酚类物质，以期为红毛藻活性物质的制备和功能食品开发提供理论依据。实验部分.主要仪器与试剂 型紫外可见分光光度计（美国 公司）；型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；型系统串联质谱仪（美国赛默飞世尔公司）；型 计（美国 公司）；型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；型电子分析天平（梅特勒托利（上海）有限公司）。福林酚（生物试剂）、，联苯基苦基肼基（，）（上海源叶生物科技有限公司）；酪氨酸、没食子酸（生物试剂，国药集团化学试剂有限公司）；吗啉丙璜酸（，北京 科技有 限 公 司）；硝 基 苯 基 丁 酸 酯（）（）、碘化硫代乙酰胆碱（）、，二硫双（硝基苯甲酸）（）、溴甲酚绿（分析纯）、盐酸小檗碱（）、牛血清白蛋白（）、乙酰胆碱酯酶（来源于电鳗，）、酪氨酸酶（来源于蘑菇，）（美国 公司）；胰脂肪酶（来源于猪胰腺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。红毛藻（）购于福建莆田市，除杂、干燥后粉碎过 目筛，得红毛藻藻粉，置于棕色干燥器备用。.实验方法.样品制备称取 红毛藻藻粉，分别使用不同浓度（、和）乙醇溶液浸提 ，重复提取 次，合并浸提液后常压过滤，于 真空浓缩后冷冻干燥得红毛藻不同浓度乙醇提取物，在 密封保存备用。.红毛藻提取物 清除能力的测定向 孔板中加入 （）样品和（）溶液，温育 后在 处测吸光度值，根据式（）计算样品的 清除能力：清除率 （）（）式中：为红毛藻提取物 吸光度值；为红毛藻提取物甲醇的吸光度值；为 甲醇水 的吸光度值。.红毛藻提取物酶抑制活性的测定.酪氨酸酶抑制活性的测定向 孔板中依次加入 （）样品、缓冲液（磷酸氢二钠磷酸二氢钠，.）、（）酪氨酸酶溶液，置于 温育 后加入 （.）酪氨酸溶液，再次于 温育 后使用酶标仪在 处测吸光度值，酪氨酸酶抑制活性按式（）进行计算：酪氨酸酶抑制率 （）（）（）式中：为红毛藻提取物酪氨酸酶测得的吸光度值；为红毛藻提取物 测得的吸光度值；为酪氨酸酶甲醇水测得的吸光度值；为 甲醇水测得的吸光度值。.乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定将 （）红毛藻提取物，溶液（，.牛血清白蛋白，.）、（.）乙酰胆碱酯酶溶液依次加入 孔板中混合均匀，置于 温育 后加入 （.），二硫双（硝基苯甲酸）溶液和 （.）碘化硫代乙酰胆碱溶液，在 反应 ，加入 无水乙醇终止反应，于 波长下检测溶液吸光度值。乙酰胆碱酯酶抑制活性按式（）进行计算：乙酰胆碱酯酶抑制率 （）（）（）式中：为红毛藻提取物乙酰胆碱酯酶测得的吸光度值；为红毛藻提取物 测得的吸光度值；为乙酰胆碱酯酶甲醇水测得的吸光度值；为 甲醇水测得的吸光度值。.胰脂肪酶抑制活性的测定参考于洋君等方法并稍作修改：将 （）样品、溶液（，无水氯化钙，.），化学试剂 第 卷第 期（）胰脂肪酶溶液依次加入 孔板中混合均匀，置于 恒温振荡器中温育 后加入 （）溶液开始反应，再次置于 下反应 ，于 波长下检测溶液吸光度值。胰脂肪酶抑制率按公式（）进行计算：胰脂肪酶抑制率 （）（）（）式中：为红毛藻提取物胰脂肪酶测得的吸光度值；为红毛藻提取物 测得的吸光度值；为胰脂肪酶甲醇水测得的吸光度值；为 甲醇水测得的吸光度值。：吗啉丙璜酸，.乙二胺四乙酸，.。.红毛藻提取物化学成分的测定.总多酚含量的测定样品中的总多酚含量采用 法进行测定，取（）提取物溶液于 容量瓶中，依次加入 福林酚显色剂及 .，超纯水定容至 ，混匀，避光反应 ，于 波长处测定吸光度。以没食子酸溶液浓度（、和 ）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线 .，.。根据标准曲线计算总多酚的含量。.总黄酮含量的测定样品中的总黄酮含量采用亚硝酸钠硝酸铝法进行测定，取（）提取物溶液于 容量瓶中，加入.亚硝酸钠，在室温下 孵 育 。第 次 孵 育 完 成 后，加 入.的 硝酸铝到容量瓶中，混合后等待 后，加入 ，混合均匀后加入甲醇水定容至 ，于 处测定吸光度。以槲皮素甲醇溶液浓度（、和 ）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线 .，.。根据标准曲线计算总黄酮的含量。.总生物碱含量的测定称取 样品，加入 盐酸溶液超声溶解，常压过滤，使用 溶液调至，再用二氯甲烷萃取 次，每次萃取 。合并二氯甲烷层，然后回收二氧甲烷，干燥、称重，即得总生物碱。柠檬酸缓冲液复溶所得总生物碱后取 ，加入 .溴甲酚绿溶液，再加 二氯甲烷，充分振荡混匀，静置 后，于 波长处测定吸光度。以盐酸小檗碱溶液浓度（、和 ）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线.，.。根据标准曲线计算总生物碱的含量。.红毛藻 乙醇提取物中多酚类化合物的鉴定取红毛藻 乙醇提取物 ，置 管中。加入 甲醇内标提取液，涡旋 ，离心 （，）。取上清液用微孔滤膜（.）过滤，保存于进样瓶中，用于 检测。液相条件：色谱柱：（.，.）；流动相：相为（甲酸）（水）.，相为（加入.的甲酸）乙腈；梯度洗脱，：，：，：，：；流速.；柱温；进样量 。质谱参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度；离子喷雾电压在正离子模式下为 ，在负离子模式下为 ；离子源气体、气体和帘气分别设置为 、和 ，碰撞诱导电离参数设置为高。.数据分析基于迈维（武汉）生物技术有限公司自建 数据库，根据二级谱信息进行物质定性，利用三重四极质谱的多反应监测模式 完成多酚物质定量，利用软件 .处理质谱数据。每个实验设定 组平行，利用 软件进行数据分析和作图，实验结果采用?的形式表示，使用 .分析软件对数据进行单因素方差分析，采用 检验来检验数据均值之间的显著差异。使用 .进行 相关性检验并分析作图。结果与讨论.红毛藻提取物 清除能力分析由于 是一种相对稳定的自由基，它可以接受电子或氢原子而成为稳定的化合物分子，广泛用于自由基清除活性的研究，本研究通过 清除活性测定红毛藻提取物的抗氧化能力。图 为红毛藻不同乙醇浓度提取物对供氢猝灭活性物质 的清除能力。由图可知，红毛藻不同乙醇浓度提取物的 清除能力与乙醇浓度有关且具有一定的差异。其中水提取物对 的清除率最高，为（.）；其次为第 卷第 期常高萍等：红毛藻不同乙醇浓度提取物的生物活性及其成分分析乙醇提取物，清除率为（.）；、乙醇浓度提取物的 清除率无显著性差异，分别为（.）、（.）和（.）；乙醇浓度提取物的 的清除率最低，为（.）。等对褐藻泡叶藻中的抗氧化物质的提取工艺进行了优化，结果表明，清除活性随乙醇浓度（）的增加而增加，本研究也获得了类似的结果。小写字母不同表示差异显著，即.图 红毛藻不同乙醇浓度提取物的 清除能力 .红毛藻提取物酶抑制活性分析红毛藻不同乙醇浓度提取物对酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶和胰脂肪酶的抑制活性如图 所示。由图 可知，红毛藻不同乙醇浓度提取物对酪氨酸酶的抑制活性不同。乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制率最高，为（.）；乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制率最低，为（.）；水提取物、乙醇提取物和 乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制率无显著性差异，其抑制率分别为（.）、（.）和（.）。红毛藻提取物的酪氨酸酶活性差异可能是由其相关活性成分的含量及差异所致。等比较了杨梅不同溶剂提取物的酪小写字母不同表示差异显著，即.图 红毛藻不同乙醇浓度提取物的酪氨酸酶抑制活性 小写字母不同表示差异显著，即.图 红毛藻不同乙醇浓度提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性 小写字母不同表示差异显著，即.图 红毛藻不同乙醇浓度提取物的胰脂肪酶抑制活性 氨酸酶抑制活性，其中乙醇提取物要高于水提取物的活性。与本研究结果相似，说明红毛藻中酪氨酸酶抑制剂大部分不易溶于水，较易溶于极性小的乙醇溶剂。由图 可知，红毛藻不同乙醇浓度提取物对乙酰胆碱酯酶均有抑制作用，且不同浓度提取物之间具有一定的差异。乙醇提取物和 乙醇提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为（.）和（.），显著高于其他提取物；其次是水提取物，对乙酰胆碱酯酶抑制率为（.）；、乙醇浓度提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用无显著性差异，其抑制 率 分 别 为（.）和（.）；乙醇浓度的提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率最低，为（.）。由图 可知，红毛藻不同乙醇浓度提取物对胰脂肪酶均有抑制作用，说明红毛藻可作为胰脂肪酶抑制剂，阻止或中断胰脂肪酶将脂肪水解为甘油和游离脂肪酸，从而减少肠道吸收。乙醇浓度不同，其红毛藻提取物对胰脂肪酶的抑制作用不同。其中 乙醇浓度提取物对胰脂肪酶的化学试剂 第 卷第 期抑制率最高，为（.），显著高于其他提取物；乙醇浓度的提取物对胰脂肪酶的抑制率最低，为（.）。.红毛藻提取物成分分析图 显示红毛藻不同乙醇浓度提取物总多酚含量范围为（.），不同乙醇浓度提取物之间有显著性差异，红毛藻提取物中的总多酚含量随着乙醇浓度的增大呈现先降低后增加的趋势，这一变化趋势与不同乙醇浓度提取物的 清除力趋势基本相同。其中 乙醇提取物中总多酚物质含量最高，为（.），乙醇提取物中总多酚含量最低，为（.），结果表明提取溶剂的极性对多酚的提取具有显著影响。等研究发现，水在提取多酚类化合物方面不如极性有机溶剂，这可能是由于乙醇使大多数蛋白质沉淀，并将一些可逆结合的酚类化合物保留在溶液中，从而使总多酚的提取含量增加。小写字母不同表示差异显著，即.图 红毛藻不同乙醇浓度提取物的总多酚含量 图 显示红毛藻不同乙醇浓度提取物总黄酮含量范围为（.），红毛藻提取物中的总黄酮含量与总多酚含量