红火蚁Serpin家族基因...绿僵菌侵染下的表达模式分析_吴洪鑫.pdf

环境昆虫学报2022，44(6):1541 1552http:Journal of Environmental Entomologydoi:10.3969/j.issn.1674 0858.2022.06.24吴洪鑫，许亚婷，康泽泓，杨荣蓉，陆永跃，金丰良，许小霞 红火蚁 Serpin 家族基因鉴定及其在绿僵菌侵染下的表达模式分析 J 环境昆虫学报，2022，44(6):1541 1552红火蚁 Serpin 家族基因鉴定及其在绿僵菌侵染下的表达模式分析吴洪鑫，许亚婷，康泽泓，杨荣蓉，陆永跃，金丰良，许小霞*(华南农业大学植物保护学院昆虫学系，广东省生物农药创制与应用重点实验室，“一带一路”农业有害生物绿色防控科技产业创新院，广州 510642)摘要:丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor，Serpin)在昆虫 Toll 通路和 PPO 级联反应的防御机制中起着至关重要的作用。本研究利用现代生物信息学工具预测和分析了红火蚁 Solenopsis invicta 中 Serpin 家族的结构和功能多样性。染色体定位表明，红火蚁基因组中7 个 Serpin 基因家族成员不均匀的分布在4 条染色体上。结构域分析表明，SiSerpin 蛋白具有 Serpin 基因的保守结构，即典型的反应中心环(eactive central loop，CL)结构与 Serpin 结构域，不同成员蛋白拥有多样化的基序。系统进化分析表明，红火蚁 Serpin 蛋白与其他的昆虫 Serpin蛋白有较高亲缘关系，SiSerpin7 与烟草天蛾 Manduca sexta 的 Serpin3a 亲缘关系最近，SiSerpin12 与黄粉虫 Tenebriomolitor Serpin55 亲缘关系最近，SiSerpin13 与烟草天蛾 Serpin6 亲缘关系最近，SiSerpin4 与家蚕 Serpin27 亲缘关系最近。为了进一步明确红火蚁 Serpin 家族在绿僵菌 Metarhizium 侵染后的表达模式，用绿僵菌侵染不同体型的工蚁，荧光定量 PC(T-qPC)分析表明，红火蚁 Serpin 基因家族成员能在早期响应绿僵菌的侵染;除 SiSerpin7基因外，大型和小型两种工蚁的表达模式存在较大的差异。结果表明红火蚁 Serpin 家族作为免疫调控蛋白，能够响应绿僵菌的侵染，且在红火蚁不同体型工蚁之间存在着不同的免疫调控模式。这些发现不仅为 Serpins 的功能分析提供了理论基础，而且有可能有助于绿僵菌作为一种有效的生防剂的开发。关键词:红火蚁;金龟子绿僵菌;丝氨酸蛋白酶抑制;免疫反应中图分类号:Q968.1;S433;S476文献标识码:A文章编号:1674 0858(2022)06 1541 12基金项目:国家重点研发计划项目(2021YFD1000500)作者简介:吴洪鑫，男，1997 年生，广东开平人，硕士研究生，研究方向为农业昆虫与害虫防治;E mail:scauwhx *通讯作者 Author for correspondence:许小霞，女，博士，副教授，研究方向为生物防治，E mail:xuxiaoxia111 收稿日期 eceived:2022 09 11;接受日期 Accepted:2022 10 13Genome-wide identification of Serpin gene family in Solenopsis invicta andexpression analysis in response to Metarhizium anisopliaeWU Hong-Xin，XU Ya-Ting，KANG Ze-Hong，YANG ong-ong，LU Yong-Yue，JIN Feng-Liang，XUXiao-Xia*(Key Laboratory of Bio-Pesticide Creation and Application of Guangdong Province，“Belt andoad Initiative”Technology Industry and Innovation Institute for Biological Control of Agricultural Pests，Department of Entomology，College of Plant Protection，South China Agricultural University，Guangzhou510642，China)Abstracts:Serpins play crucial modulatory roles in the insect defense mechanism，mainly in the Tollpathway and prophenoloxidase(PPO)cascade.In the current study，we employed modern Bioinformaticstools to predict and analyse the structural and functional diversity of Serpin family in Solenopsis invicta，aninvasive and notoriously harmful species of ants.Computational analysis showed that Serpin family geneswere evenly distributed on four chromosomes.Domain analysis revealed that S.invicta Serpin(SiSerpin)环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷protein had the conserved structure，typical reactive central loop(CL)and serpin domain，whereasdifferent member proteins had diverse motifs.Phylogenetic analysis showed that the SiSerpin family had astrong relationship with Serpin genes from other insect species.SiSerpin7 was most closely related toSerpin3a of Manduca sexta，and SiSerpin12 was strongly related to Serpin55 of Tenebrio molitor.Similarly，SiSerpin13 was found to be in close homology with Serpin6 in M.sexta while SiSerpin4 wasclosely linked to Bombyx mori Serpin27.To further understand the role of SiSerpin in immune response，the S.invicta were infected with Metarhizium anisopliae，an insect pathogenic fungi.T-qPC resultsshowed that the expression profiles of SiSerpin family greatly varied at the initial stages of infection，anindicator of their regulatory potential during fungal stress.It was worth mentioning that the expressionpatterns differed in small and large worker ants.These results presented an intricate immuno-regulatorypotential of the Serpin family of S.invicta in response to the fungal infection.We also noted thedifference in immune responses amongst different sizes of the ants.These findings not only provide atheoretical basis for the functional analysis of Serpins，but could potentially assist in the development ofM.anisopliae as an effective biocontrol agent of S.invictaKey words:Solenopsis invicta;Metarhizium anisopliae;Serpin;immune responses丝氨酸蛋白酶(Serine protease，SP)是一类重要的蛋白水解酶家族，能够参与多种生理过程(Veillard et al.，2016)。丝氨酸蛋白酶以丝氨酸为活性中心，其催化结构域由组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸 3 个氨基酸残基组成(Jiang et al.，2000)。在昆虫中主要参与消化、发育和先天免疫反应等重要生理过程(Zou et al.，2006)。丝 氨 酸 蛋 白 酶 抑 制 剂(Serineproteasesinhibitor，Serpin)是丝氨酸蛋白酶最有效的抑制因子。Serpin 家族一般由 350 500 个氨基酸组成，其 C 末端含一个约有 20 个氨基酸组成的反应中心环(reactive central loop，CL)，研究表明这类抑制剂为单一肽链的球状蛋白质，并且各种 Serpins大约有 30%的序列同源性，疏水区同源性高达70%(周诗敏等，2021)。Serpins 主要功能是抑制丝氨酸蛋白酶的活性，通过调控丝氨酸蛋白酶级联反应，参与昆虫的体液免疫反应(Tong et al.，2005;Veillard et al.，2016)。Serpins 通过不可逆的结合丝氨酸蛋白酶，形成非共价复合物，调控昆虫体液免疫反应的 Toll 通路和黑化反应，通过抑制 PPO 途径和 Toll 通路中的丝氨酸蛋白酶活性，调控昆虫的免疫反应(赵丽芳等，2016)。Serpins 作为一种免疫功能调控蛋白，昆虫体内 Serpin 蛋白的表达可以被许多外来病原物诱导，包括细菌、真菌等。早在 1998 年，研究者们就在美国白蛾 Hyphantria cunea 中发现能够被细菌激烈诱导表达的 Serpin 蛋白 Hdd3(Shin et al.，1998)，在随后的研究中，发现 Hdd3 蛋白主要存在于血浆中并能通过竞争性抑制酚氧化酶原 PPO 的活性从而下调昆虫的黑化反应(Park et al.，2000)。Wang 等人研究表明，饲喂靶向 Serpin1 的 dsNA可显 著 增 加 绿 僵 菌 侵 染 后 东 亚 飞 蝗 Locustamigratoria manilensis 的 死 亡 率，且 防 治 效 果 和dsNA 浓度呈剂量依赖性(Wang et al.，2022)。红火蚁 Solenopsis invicta 于 2004 年首次报道入侵中国大陆(曾玲等，2005)。作为一种外来入侵物种，红火蚁因其习性凶猛、繁殖力大、环境适应性强等特点，被世界自然保护联盟(IUCN)列为 100 种最具有破坏力的入侵生物之一(陆永跃等