红火蚁病原真菌AUGM47早期发育超微结构研究_雷妍圆.pdf

环境昆虫学报2022，44(6):1510 1516http:Journal of Environmental Entomologydoi:10.3969/j.issn.1674 0858.2022.06.21雷妍圆，官昭瑛，Abid Hussin 红火蚁病原真菌 AUGM47 早期发育超微结构研究 J 环境昆虫学报，2022，44(6):1510 1516红火蚁病原真菌 AUGM47 早期发育超微结构研究雷妍圆1，官昭瑛2*，Abid Hussin3(1.广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640;2.深圳技师学院，深圳 518116;3 费萨尔国王大学农业与食品科学学院，沙特阿拉伯胡富夫 31982)摘要:在前期筛选已获得对红火蚁 Solenopsis invicta Buren 高效致病真菌罗伯茨绿僵菌 Metarhizium robertsiiAUGM47 的基础上，为进一步明确病原真菌对寄主昆虫的侵染机制。本试验在室内条件下，以红火蚁工蚁为侵染对象，利用荧光显微镜和透射电镜观察了罗伯茨绿僵菌 AUGM47 侵染单元分生孢子在体表附着萌发、穿透和体内增殖的早期发育过程。结果表明，菌株 AUGM47 分生孢子在红火蚁体表可萌发并形成附着胞侵入，接种后12 h 观察到萌发，在 36 h 内普遍出现穿透结构穿透体壁。接种后 48 h 为菌体在血腔内的增殖阶段。菌丝体在穿透表皮和体腔内增殖过程中伴随着机械压力和酶的活动。接种后 96 h，观察到自噬现象，菌体通过自噬降解并回收细胞器，为从体内穿出的晚期发育过程提供物质基础。本研究对罗伯茨绿僵菌 AUGM47 分生孢子在红火蚁体外至体内的发育进程研究证实了菌株的高致病性，为红火蚁生防真菌菌种改良和后续开发利用奠定理论基础。关键词:红火蚁;病原真菌;罗伯茨绿僵菌;早期发育;分生孢子中图分类号:Q968.1;S433;S476文献标识码:A文章编号:1674 0858(2022)06 1510 07基金项目:国家重点研发计划项目(2021YFD1000500);深圳技师学院博士发展基金(2214007)作者简介:雷妍圆，女，博士，副研究员，主要从事农业害虫生物防治研究，E mail:leiyy *通讯作者 Author for correspondence:官昭瑛，博士，高级工程师，研究方向为昆虫生态学，E mail:收稿日期 eceived:2022 09 22;接受日期 Accepted:2022 10 16Ultrastructural studyofearlyinfectionofentomopathogenicfungiMetarhizium robertsii against Solenopsis invictaLEI Yan-Yuan1，GUAN Zhao-Ying2*，Abid Hussin3(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of HighTechnology for Plant Protection，Institute of Plant Protection，Guangdong Academy of AgriculturalSciences，Guangzhou 510640，China;2.Shenzhen Institute of Technology，Shenzhen 518116，China;3.College of Agricultural and Food Sciences，King Faisal University，Hofuf 31982，Saudi Arabia)Abstract:In this study，based on the previous screening of the high pathogenic Metarhizium robertsiistrainAUGM47ofSolenopsisinvicta，tobetterunderstandtheinfectionmechanismofthisentomopathogenic fungi against pest host，the development at an early-stage associate with germination，attachment，penetration and conidial reproduction of M.robertsii strain AUGM47 in worker ant of S.invicta were observed using fluorescent microscopy and transmission electron microscope methods.Comparative observation with light microscopy and electron microscopy showed:Appressoria formationwas the terminal act of germination.Strains AUGM47 began to germinate within 12 h，and penetrationswere commonly observed within 36 h.Within 48 h post-inoculation，the hyphal bodies colonized the bodycavity.The penetration and propagation of the hyphal bodies was accompanied by a combination ofmechanical pressure and enzymatic action during the infection process.After 96 h post-inoculation，autophagy occurs，organelles were degraded and recycled through an autophagic process，to provide6 期雷妍圆等:红火蚁病原真菌 AUGM47 早期发育超微结构研究energy needs of late stage of infection in vitro.The structural characteristics of conidial development wereexplored while the highly pathogenic of M.robertsii strain AUGM47 was confirmed，this study will furtherprovide the theoretical basis and reference for strain improvement and field application.Key words:Solenopsis invicta;pathogenic fungi;Metarhizium robertsii;early-stage of infection;conidia红火蚁 Solenopsis invicta Buren 是一种来自南美洲的入侵性蚂蚁，极具破坏力，在中国已传播至12 个省份 448 个县市区(农业农村部办公厅，2021)，根除已经不可能，对红火蚁的生物控制，特别是病原微生物控制，被视为可持续的抑制策略。在昆虫病原微生物种类中(细菌、真菌和病毒)，真菌通过主动侵染控制虫体而不依赖寄主的生活习性，其侵染是一个连续性的过程，可划分为接触期、侵入期、潜育期和水平传播期。首先是真菌侵染单元分生孢子与侵染部位接触(angelet al.，2008;Chouvenc et al.，2009)，当外界条件适宜时孢子萌发形成芽管和菌丝，芽管或菌丝末端膨 大 形 成 侵 染 结 构 附 着 胞(Amra et al.，2010)，在机械压力和酶类物质降解作用下侵入寄主昆虫，在寄主体内生长增殖，使寄主发病显示致病症状，菌体穿出表皮并产生新的分生孢子水平扩散(Stone and Bidochka，2020)。真菌侵染害虫的过程是与寄主相互抗衡的过程，除了主动侵染，还需要克服寄主行为和生理上的防御反应(Ortiz-Urquiza and Keyhani，2013)，只有当菌体成功侵入并在寄主体内大量增殖致其发病，两者才算真正建立寄生关系，因而分生孢子从接触至潜育的早期发育时期，对侵染成败具有决定性作用。红火蚁的土栖和群居习性有利于病原微生物控制策略，然而作为一种社会性昆虫，它们已经高度进化，具有许多独特的社会行为帮助其生存，包括一系列使种群免受真菌或其他微生物侵害的防御机制，如分泌抗生素、清理巢穴、梳理行为和逃避行为等，虽然这些行为未必针对微生物而进化，但对病原真菌的侵染和传播效率有消极影响。尽管在微生物防治上人们做了不少努力，但目前实际应用微生物成功防治红火蚁还鲜有报道。另一方面，由于自然界中确实存在且常有真菌寄生蚂蚁的现象，一些真菌已被证明可以在蚁巢内自然传播和削弱红火蚁巢，因而寻找有效微生物对红火蚁进行生物控制仍具有研究价值。国内外有关红火蚁病原真菌的工作主要集中在菌株分离鉴定和防效评价(杨佳后等，2009;吕利华等，2011;Kafle et al.，2012;刘晓燕等，2014;王磊等，2014，2018;Li et al.，2016;ojas et al.，2018;吴志鹏和童应华，2020;樊春丽等，2022)、菌剂研制(王磊等，2016;Qiu et al.，2019)以及基因工程改造等方面(Fan et al.，2012)。而关于病原真菌对红火蚁识别、附着、穿透以及血腔定殖等侵染过程的机制研究尚无报道。本课题组通过前期对红火蚁昆虫病原真菌种类及防治潜能的评估，已鉴定出一株对红火蚁具有高 致 病 性 的 病 原 真 菌 罗 伯 茨 绿 僵 菌 菌 株AUGM47，其接种红火蚁工蚁后第 7 天的致死中浓度(LC50)为 4.52 106孢子/mL，表现出极大的生防潜力。最新研究显示，罗伯茨绿僵菌既是植物根际有益真菌，又是昆虫病原真菌，可开发成兼具生物农药和生物肥料的菌剂(Meng et al.，2021)。罗伯茨绿僵菌具有典型的真菌侵染阶段，关于这种病原真菌对红火蚁的侵染模式尚未开展相关研究，其侵染结构形成和侵入方式仍不得而知。鉴于红火蚁具有社会性昆虫复杂的防御系统，对该菌早期发育的研究，有助于深入了解其侵染机制，并以此制定相应防治策略。本文以该菌株为材料，利用荧光和电子显微镜观察其分生孢子侵染红火蚁过程中的微观结构特征，以明确互作体系中菌体侵染与寄主致病性的相关性，为进一步评估其宿主特异性和释放潜力提供理论依据。1材料与方法1.1供试虫源和菌株培养红火蚁蚁巢采自广州市白云区钟落潭镇广东省农业科学院白云基地，参照吕利华等(2006)方法开展田间采集、室内蚁群分离及饲养。供试蚂蚁分别置于内壁涂了滑石粉的保鲜盒(长380 mm、宽 300 mm、高 200 mm)中，盒内放置人工蚁巢，保持在 25、相对湿度 70%条件下，以 25%蜂蜜水和黄粉虫饲养。供试罗伯茨绿僵菌 AUGM47 保存于广东省农业科学院植物保护研究所，经致病力测定证实对红火蚁具有较强致病力。将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(马铃薯 200 g/L、葡萄1151环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷糖 20 g/L、琼脂 20 g/L、蒸馏水 1 000 mL)，于温度 27 1，相对湿度 70%5%，光周期 L D=14 h 10 h 的恒温培养箱中培养 20 d 后供试。1.2接种及取样方法用灭菌软毛笔将 PDA 平板上的分生孢子粉刷入装有灭菌 0.05%吐温-80 溶液的烧杯(50 mL)中，经涡