黄瓜靶斑病生防芽胞杆菌的分离鉴定及其抑菌作用_张晓云.pdf

39(1)194-203 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-04-29 基金项目：河北省重点研发计划（20326515D）；河北省农林科学院科技创新专项（2022KJCXZX-ZBS-1）作者简介：张晓云，硕士，副研究员，E-mail：zxy_；*通信作者，博士，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.002 黄瓜靶斑病生防芽胞杆菌的分离鉴定及其抑菌作用 张晓云，丛 蓉，郭庆港，鹿秀云，苏振贺，陈秀叶，李社增，马 平*（河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治创新中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，保定 071000）摘要：由多主棒孢霉引起的黄瓜靶斑病是近年来危害严重的黄瓜病害之一，为获得有效防治黄瓜靶斑病的生防细菌，本研究采用平板对峙法及盆栽试验，获得一株有效防治黄瓜靶斑病的生防细菌 HMB28521；根据形态学、生理生化特征及 16S rDNA 联合 gyrA、gyrB、rpoB 和 rpoC 多基因序列的系统发育分析将HMB28521 菌株鉴定为贝莱斯芽胞杆菌；液相色谱分离与质谱鉴定结果表明，HMB28521 菌株可以产生伊枯草菌素（iturin）、丰产素（fengycin）和表面活性素（surfactin），抑菌试验证明 iturin 和 fengycin 是该菌株产生的主要抑菌活性物质，二者能够显著抑制多主棒孢霉的生长，并且造成菌丝畸形。本研究为黄瓜靶斑病的生物防治提供了新的资源并为进一步明确该菌的作用机理提供了理论基础。关 键 词：多主棒孢霉；生防细菌；抑菌作用；脂肽 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0194-10 Isolation,Identification and Evaluation of Biocontrol Bacteria against Cucumber Target Spot ZHANG Xiaoyun,CONG Rong,GUO Qinggang,LU Xiuyun,SU Zhenhe,CHEN Xiuye,LI Shezeng,MA Ping*(Plant Protection Institute,Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Innovation Centre of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Baoding 071000,China)Abstract：Cucumber target spot caused by Corynespora cassiicola is a serious disease of cucumber in recent years.Bacterial strain HMB28521 with potential biocontrol ability for cucumber target spot was obtained by dual culture method and pot experiment in greenhouse.Strain HMB28521 was identified as Bacillus velezensis based on morphological,physiological,biochemical characteristics,16S rDNA sequence analysis,as well as phylogenetic tree inferred from the alignment sequence of gyrA,gyrB,rpoB and rpoC.Lipopeptides iturin,fengycin,and surfactin were isolated,purified and identified from strain HMB28521 by fast protein liquid chromatography(FPLC)and UPLC-Triple TOF-MS/MS.The iturin and fengycin showed strong inhibitory abilities against the growth of C.cassiicola,as well as causing abnormal hyphal growth in vitro.This study provided new resources for the biological control of cucumber target leaf spot and a theoretical basis for further clarifying the action mechanism of the biocontrol bacteria.Key words:Corynespora cassiicola;biocontrol bacteria;antifungal activity;lipopeptide 黄瓜靶斑病是由多主棒孢霉 C.cassiicola 引起的一种世界性病害，又称黄瓜褐斑病、黄瓜棒孢叶斑病等1。该病主要为害黄瓜叶片，严重时也可侵染叶柄和茎蔓，病斑圆形、多角形或不规则形，中央常有明显的眼状靶心2。随着设施黄瓜种植规模的不断扩大，黄瓜靶斑病蔓延趋势明显，在山东、河北、辽宁、内蒙古等地大面积发生3，严重影响黄瓜的产量和品质，已成为保护地黄瓜生产中亟需解决的重要叶部病第 1 期 张晓云等：黄瓜靶斑病生防芽胞杆菌的分离鉴定及其抑菌作用 195 害之一。我国对黄瓜靶斑病的研究报道较少，现有的研究主要集中在病原菌的分离鉴定4,5、病原菌 PCR检测方法的建立3,6及室内防治药剂筛选7,8等方面。目前，该病的防治主要以化学农药为主，化学农药长期使用，容易使病原菌产生抗药性且造成生态环境污染，危害人类健康。因此，寻找一种安全、高效、环境友好的生物防治措施对黄瓜绿色生产具有重要意义。微生物杀菌剂是防治植物病害行之有效且环境友好的措施之一，已广泛应用于各类病害的生物防治，并取得理想的防治效果。目前，国内（中国农药信息网 http:/ 9 种，其中只有 1 种微生物杀菌剂（1000 亿活孢子/g 荧光假单胞杆菌可湿性粉剂），因此，需要继续创制防治黄瓜靶斑病的微生物杀菌剂。获得高效防治靶斑病的生防菌是创制微生物杀菌剂的前提，国内外已有报道表明，木霉菌、放线菌和贝莱斯芽胞杆菌可抑制多主棒孢霉的生长，表现出防治黄瓜靶斑病的效果9-11。本文以多主棒孢霉为拮抗对象，通过室内平板对峙与温室盆栽试验，筛选获得高效生防细菌；结合形态学、生理生化及多基因系统发育树，明确其分类地位；同时对其抑菌物质进行初步分离鉴定，为黄瓜靶斑病的生物防治提供新的资源。1 材料与方法 1.1 材料 供试病原菌：黄瓜靶斑病病原菌多主棒孢霉由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室分离并保存。供试细菌：采用常规系列稀释法自河北 3 个县市棉花、番茄、黄瓜及草莓等作物根围土壤及西藏 7 个县市的 84 份土样中分离获得的 985 株细菌，用于多主棒孢霉拮抗菌的筛选。LB 固体培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，H2O 1000 mL，pH 值 7.07.2；LB 液体培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，H2O 1000 mL，pH 7.07.2；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g、琼脂粉 15 g、H2O 1000 mL；Landy培养基：葡萄糖 20 g、L-谷氨酸钠 5 g、MgSO4 0.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO4 1 g、FeSO4 0.15 mg、MnSO4 5 mg、CuSO4 0.16 mg、H2O 1000 mL。供试黄瓜品种：津优 1 号，天津科润农业科技股份有限公司生产。供试试剂：PCR 扩增试剂、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR所需引物的合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；结晶紫染色液：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2 g 溶于 20 mL 95%乙醇中）20 mL，1%草酸铵水溶液 80 mL，两液混匀置 24 h 后过滤即成。1.2 多主棒孢霉拮抗细菌的筛选 采用平板对峙法12测定 985 株供试细菌对多主棒孢霉的拮抗作用。在 PDA 平板中央接种直径 6 mm的多主棒孢霉菌盘，25 培养 3 d 后，在菌落边缘打取菌饼转接到另一个 PDA 平板中央，将活化后的供试细菌点接在距多主棒孢霉菌盘 2 cm 处，以不接种供试细菌为空白对照。25 培养 57 d 后，测量多主棒孢霉对照菌落生长半径、处理菌落生长半径和抑菌带，计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照菌落生长半径-处理菌落生长半径）/对照菌落生长半径100。以抑菌带和抑菌率为指标初步筛选对多主棒孢霉有较强拮抗作用的细菌菌株。1.3 黄瓜靶斑病生防细菌的盆栽试验评价 将初筛的多主棒孢霉拮抗细菌划线接种于 LB 平板培养基上，37 培养 12 h 后挑取单菌落转接入 LB培养液中，30、180 r/min 培养 48 h 后得到发酵液备用。选取长至 34 片真叶且长势一致的黄瓜幼苗，将稀释后的发酵液（1108 CFU/mL）均匀喷洒于叶片上，24 h 后喷雾接种多主棒孢霉分生孢子悬浮液（1106 孢子/mL），接种后将黄瓜幼苗置于 25 人工气候室中保湿培养（湿度保持80%）。每处理 8 株黄瓜苗，3 次重复。以喷施 43%氟菌肟菌酯 1000 倍液（PD20152429，德国拜耳作物科学公司）作为化学药剂对照，以喷施清水为空白对照。79 d 后待空白对照充分发病时调查发病情况，计算病情指数与防效13。病情指数（各级病叶数代表数值）/（调查总叶数最高代表级值）100。防治效果（%）（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数100。196 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 1.4 生防细菌 HMB28521 菌株的分类鉴定 1.4.1 形态特征观察 HMB28521 菌株的形态特征观察参考常见细菌系统鉴定手册14的方法进行。将HMB28521 菌株划线接种于 LB 平板培养基上，37 培养 24 h 后观察单菌落形态。挑取单菌落转接入 LB培养，30、180 r/min 振荡培养 36 h 后进行结晶紫染色，显微镜下（10100 倍）观察 HMB28521 菌株的菌体及芽胞形成情况。1.4.2 生理生化特征测定 HMB28521 菌株的生理生化特征测定参考常见细菌系统鉴定手册14的方法进行，包括游动性试验、接触酶试验、V-P 试验、M-R 试验、耐盐性试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解、明胶液化、硝酸盐还原等生理生化试验。1.4.3 分子生物学鉴定 利用天根生化科技（北京）有限公司基因组 DNA 提取试剂盒提取 HMB28521 菌株基因组 DNA 后，利用细菌 16S rDNA 的通用引物 27F（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3）和 1492R（5-GGCTACCTTGTTACGACTT-3）对菌株 HMB28521 的 16S rDNA 序列进行 PCR 扩增，通过序列比对初步确定细菌属级水平的分类地位。通过对菌株 HMB28521 全基因组序列进行分析，