花椒根腐病拮抗真菌的分离鉴定及其生防潜力探究_李梦玮.pdf

39(1)176-183 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-04-19 基金项目：四川省科技计划项目（2021YFN0116）作者简介：李梦玮，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，张楠楠，助理研究员，E-mail：；石福孙，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.001 花椒根腐病拮抗真菌的分离鉴定及其生防潜力探究 李梦玮1,2,3，陈晓霞1,2,3，补欢欢1,2,3，廖礼彬1,2,3，李婧怡1,2,3，张楠楠1,3*，石福孙1,3*（1.中国科学院成都生物研究所，成都 610041；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国科学院茂县山地生态系统定位研究站，茂县 623200）摘要：为获得花椒根腐病菌腐皮镰孢菌 Fusarium solani 的优良拮抗菌株，本研究以健康花椒侧根为拮抗菌来源，采用组织分离法获得花椒根部内生真菌，通过平板对峙法筛选出 1 株对病原菌具备明显拮抗作用的真菌 HB21-1，平板抑制率为 61.00%，其无菌发酵滤液抑制率为 41.24%，可致腐皮镰孢菌菌丝出现皱缩膨胀、孢子畸形现象，经形态学和分子生物学鉴定为草酸青霉 Penicilium oxalicum。盆栽试验结果表明 HB21-1对花椒根腐病的防效为 56.59%，经 HB21-1 处理的花椒根部 POD、SOD 酶活性和土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶活性随时间均呈升高趋势，且始终高于空白对照。本研究表明草酸青霉 HB21-1 对花椒根腐病病原菌具有显著拮抗作用，能降低发病率，在生物防治方面有潜在应用价值。关 键 词：花椒；根腐病；草酸青霉；生物防治；防御酶活性；土壤酶活性 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0176-08 Isolation,Identification and Biocontrol Potential of Antagonistic Fungi against Zanthoxylum bungeanum Root Rot LI Mengwei1,2,CHEN Xiaoxia1,2,BU Huanhuan1,2,LIAO Libin1,2,LI Jingyi1,2,ZHANG Nannan1*,SHI Fusun1*(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Maoxian Mountain Ecosystem Research Station,Chinese Academy of Sciences,Maoxian 623200,China)Abstract:In order to obtain good antagonistic strains against Fusarium solani,the endophytic fungus of Zanthoxylum bungeanum root was screened by tissue isolation method.The strain HB21-1 with inhibition rate of 61.00%against F.solani was obtained by plate confrontation method.The inhibition rate of its sterile fermentation filtrate against F.solani was 41.24%.The strain of HB21-1 induced constriction,enlargement in mycelia morphology of F.solani and caused spore deformity.Based on the morphological characteristic and ITS molecular sequences,The strain of HB21-1 was identified as Penicillium oxalicum.The effect of HB21-1 on root rot of Zanthoxylum bungeanum was 56.59%in the pot experiment.The POD and SOD enzyme activities,soil sucrase and acid phosphatase activities of Zanthoxylum bungeanum roots treated with HB21-1 were increased compared with the control.This study shows that P.oxalicum HB21-1 had a significant antagonistic effect on F.solani and reduced the incidence of the root rot of Zanthoxylum bungeanum.Key words:Zanthoxylum bungeanum;root rot;Penicillium oxalicum;biological control;defense enzyme activity;soil enzyme activity 花椒 Zanthoxylum bungeanum Maxim.属于芸香科、花椒属落叶小乔木，用途广泛且栽培范围广、产量高1，是四川省内农业发展的经济林品种之一。但花椒易受多种病害侵袭，其中根腐病是危害花椒最重要的病害之一，可致花椒死亡率达 35.50%51.51%2，严重时可造成毁园，影响花椒产量、品第 1 期 李梦玮等：花椒根腐病拮抗真菌的分离鉴定及其生防潜力探究 177 质和农民收入。花椒根腐病主要由腐皮镰孢菌 Fusarium solani 引起3，其症状表现为根系腐烂，根皮与木质部易脱离，严重时木质部呈黑色，根系逐渐丧失活性，最后发展为全株枯死，是一种易传染、发病率高的根部土传病害。花椒根腐病的防治方法主要有农业、化学和生物防治。农业防治以选择无发病史的种植地、合理灌溉施肥、园区通风等方法为主，但花椒是多年生木本植物，很难有效预防根腐病。化学药剂对花椒根腐病有一定的防治效果，朱天辉等4研究表明 15%的粉锈宁药剂能预防根腐病；蒋其军等5研究认为根腐净、福美双等多种药剂成比例混合对病原菌有抑制作用，但长期使用会使植株产生抗药性，也会引发一系列生态环境问题。生物防治通过引入对病原菌有抑制作用的拮抗细菌、真菌等有益菌来防控植物病害，具有绿色、无公害的特点。目前花椒根腐病的生物防治研究有李姝江等1发现高浓度的蜡样芽孢杆菌对花椒根腐病有明显抑制作用，在田间试验中预防率可达 100%；田凤鸣等6探究了 2 种木霉复配对花椒根腐病病原菌的抑制效果为 88%；郭志斌等7发现淡紫拟青霉对花椒根腐病菌起抑制作用的主要是其发酵代谢产物。内生菌是指生活史的一定阶段或全部阶段处于健康植物组织内部的微生物8，不但能与植物互惠共生，还具有促生、提高植株抗虫、抗病性的作用，是植物微生态系统中重要的组成部分。由于真菌相比于细菌、放线菌具有易培养、产孢力强、利于生产的优点9，因此分离、筛选具有拮抗作用的内生真菌对防治植物病害、农业的可持续发展具有重要意义。丁锐等10从兰科植物羊耳蒜的根部分离得到 1 株多节孢属真菌对油菜菌核病菌具有强拮抗作用；姚晨虓等11从烟草根际土壤中分离出 1 株棘孢木霉对尖孢镰刀菌的抑制率可达 93.13%；Edwige 等12从番茄根际土壤中分离并筛选出 10 株对白腐病有抑制作用的拮抗真菌，防效最高可达 60%；Yusnawan 等13从根际土壤中分离出的木霉菌对多种植物病害的病原菌有不同程度的拮抗作用。花椒根部内生真菌的分离及其对根腐病的防治作用同样值得探究，因此本研究选取健康花椒根部组织，从中分离获得一株对根腐病病原菌具有拮抗作用的内生真菌，以形态学和分子生物学方法对其进行鉴定。通过盆栽试验测定其防效及对花椒根部防御酶、土壤酶活性的影响，来探究拮抗真菌对病原菌的生防潜力，为花椒根腐病的生物防治提供理论依据及实际指导意义。1 材料与方法 1.1 供试材料 供试植物组织：2021 年 8 月于四川省阿坝州茂县感根腐病的某花椒种植园区，选取健壮未发病的花椒树采集其侧根备用。供试病原菌：腐皮镰孢菌 F.solani 为本实验室前期从患病花椒根部分离、鉴定并保存。供试花椒：“大红袍”一年生幼苗，购于阿坝州茂县五月脆农业技术开发有限公司。供试培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯浸出粉 6 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水 1000 mL。马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：除不加琼脂外，其他同 PDA。以上培养基均经过 121 灭菌 15 min。1.2 试验方法 1.2.1 拮抗真菌分离纯化 将花椒根部用灭菌小刀切成5 mm的小段，将其依次置入75%酒精2 min、1%次氯酸钠溶液 3 min、0.01 mol/L 磷酸缓冲溶液 3 min 进行表面消毒，无菌水冲洗 5 次后在无菌吸水纸上吸干其表面水分。每个 PDA 平板上均匀放置 5 段，置于 28 培养箱中黑暗培养 7 d。将长出的真菌菌丝及时用接种针挑取，划线接种在 PDA 上，多次重复分离纯化操作直至获得纯培养菌株。1.2.2 拮抗真菌筛选 以腐皮镰孢菌为指示菌，分别进行（1）初筛：用 6 mm 的打孔器将指示菌打成菌饼接种在 PDA 平板中央，将上述分离纯化获得的真菌分别接种在指示菌四周，与菌饼圆心相距 2.5 cm，空白对照 PDA 平板中央仅放置腐皮镰孢菌菌饼。（2）复筛：参照文献14方法并略有改进。将初筛获得的拮抗真菌接种至 PDB 培养液中，28、120 r/min 振荡培养 7 d 后，将菌悬液以 7000 r/min 离心 10 min，上清液经 0.22 m 针式过滤器过滤，获得无菌发酵滤液。将其与 PDA 以 1:9 比例混合制成平板，以含 10%无菌水的 PDA 为空白对照，在平板中央接种病原菌。初筛、复筛均设 3 次重复，28 培养 37 d，十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。抑制率（%）（对照菌落直径处理菌落直径）/对照菌落直径100。178 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 1.2.3 拮抗真菌 HB21-1 对腐皮镰孢菌菌丝、孢子生长的影响 在拮抗真菌 HB21-1 与腐皮镰孢菌的平板对峙试验中，分别挑取对照组病原菌、处理组病原菌菌落的边缘菌丝制成玻片，于光学显微镜下观察病原菌菌丝、孢子形态特征。1.2.4 拮抗真菌 HB21-1 形态学鉴定 将拮抗真菌 HB21-1 接种于 PDA 中央，28 黑暗培养 37 d，在菌株生长期间记录菌落质地、颜色，并在显微镜下观察孢子形态，对拮抗真菌进行初步形态鉴定。1.2.5 拮抗真菌 HB21-1 分子生物学鉴定 采用 TSINGKE 植物 DNA 提取试剂盒提取菌株 DNA。选用真菌通用引物 ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3和 ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（50 L）：引物 ITS1/ITS4 各 2 L、Taq Mix 25 L、DNA 模板 1 L，超纯水 20 L。PCR 反应程序：95 预变性 2 min；98 变性 10 s，53 退火 10 s，72 延伸 10 s，循环 39 次；72 延伸 10 min，4