化妆品原料的过敏性体外方法...（ADRA）方法转化与验证_沈立.pdf

第 53 卷 第 2 期2023 年 2 月Vol.53 No.2Feb.2023157 日 用 化 学 工 业（中英文）China Surfactant Detergent&Cosmetics In chemico skin sensitisation:Amino acid Derivative Reactivity Assay（ADRA）transformation and validationLiShen*,XuemeiWang,HuiwenZhang,YaqiongSuo,JingWu,ShuxiaXing（National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China）Abstract:A skin sensitizer refers to a substance that will lead to an allergic response following repeated skin contact as defined by the United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals.The current knowledge of the chemical and biological mechanisms associated with skin sensitisation has been summarised as an Adverse Outcome Pathway（AOP）starting with a molecular initiating event through intermediate events to the adverse effect,namely allergic contact dermatitis.Using cysteine and lysine derivatives instead of skin tissue,simulating the reaction of skin proteins with compounds,classifying the substances by calculating the percentage of depletion value after the reaction of cysteine and lysine derivatives to distinguish skin sensitizers and desensitizers,this method is called Amino acid Derivative Reactivity Assay（ADRA）.In this study,ten known allergens were selected to explore the accuracy of the sensitivity evaluation of ADRA method,and verified accuracy by DPRA that several substances were randomly selected among the ten substances.The results show that the sensitivity determination results of 10 substances are consistent with the sensitivity of samples,and the accuracy of determination of ADRA sensitivity is good.Key words:skin sensitisation;alternatives experiment;ADRAReceived:February 14,2022;Revised:February 3,2023.*Corresponding author.Tel.:+86-18720913402,E-mail:.DOI：10.3969/j.issn.1001-1803.2023.02.005158第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）化妆品的使用特点为反复多次接触皮肤，因此皮肤过敏性评价是化妆品毒理学评价的重要内容。以往，化学物质潜在致敏及其效力数据需要从动物实验中获取，随着实验动物福利3R原则日趋受到重视，此法在现如今的环境下已经越来越不可取，因此合适的替代方法对于化妆品安全性评价尤为重要。人们对于皮肤致敏有关的化学和生物学机制的当前知识已概括为不良结果通路（The Adverse Outcome Pathway，AOP）1，这条通路始于分子引发事件，再经历中间事件后到达不良反应，有4个关键事件。分子引发事件（即第一个关键事件）是亲电物质与皮肤蛋白中的亲核中心共价结合，皮肤与物质接触后，可能与皮肤上的蛋白结合形成抗原，导致不良反应。且已探知表现出皮肤敏化潜能的绝大多数测试化学物质优先与体内蛋白质的半胱氨酸和赖氨酸残基结合2。本文的目的是介绍与验证转化OECD中收录的此关键事件的体外替代实验氨基酸衍生化反应（Amino acid Derivative Reactivity Assay，ADRA）3。1 实验部分1.1 主要试剂与仪器N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）、-N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL），纯度均98%，日本富士公司；苯乙醛（纯度95%）、苯甲醇（纯度99%）、甘油（纯度99%），上海麦克林试剂；对苯醌（纯度98.80%），美国TMstandard试剂；对羟基苯甲酸丙酯（纯度99.60%），中国食品药品检定研究院；棕榈酰氯（纯度98%），比利时ACROS试剂；间苯二甲酸二甲酯（纯度99.80%）、肉桂醛（纯度99.10%），美国CATO试剂；氯胺T（纯度99.80%）、咪唑烷基脲（纯度91.20%），北京Bepure试剂；金合欢醇（纯度94.20%），德国DR EHRENSTORFER试剂；三氟乙酸（TFA、色谱纯），美国Alfa Aesar试剂；氢氧化钠（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（分析纯）、磷酸二氢钠（纯度99%）、磷酸氢二钠（纯度99%），国药集团；乙腈（色谱纯），美国Thermo Fisher公司；实验用水为娃哈哈纯净水。1260 Infinity型高效液相色谱仪（DAD检测器），美国Agilent Technologies公司；Cllimacell222型恒温恒湿培养箱，美国Thermo Fisher公司；VORTEX-5型涡旋混合器，江苏Kylin-Bell公司；CF16RX 型高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；Seven Excellence型pH计、XP205分析天平、AL204分析天平，美国Mettler toledo公司。1.2 实验方法1.2.1 实验方法原理受试化学品与NAC和NAL两种氨基酸衍生物（结构式见图1）模拟的皮肤蛋白共同反应。通过下式计算反应后氨基酸衍生物色谱图峰面积减少值的百分比，以此区分皮肤敏化剂和非敏化剂。化妆品原料的过敏性体外方法氨基酸衍生化反应法（ADRA）方法转化与验证沈 立*，王雪梅，张慧文，所雅琼，吴 景，邢书霞（中国食品药品检定研究院，北京 100050）摘要：在皮肤致敏不良结果通路（AOP）的第一个关键事件中化学反应为亲电物质与皮肤蛋白中的亲核中心共价结合，即皮肤与物质接触后，可能与皮肤上的蛋白结合形成抗原，导致不良反应。采用半胱氨酸和赖氨酸衍生物替代皮肤组织，模拟皮肤蛋白与化合物结合，通过计算半胱氨酸和赖氨酸衍生物反应后耗竭值（百分比）将物质分类，以此区分皮肤敏化剂和非敏化剂，此种方法称之为氨基酸衍生化反应法（ADRA）。本实验选择10种致敏性已知的物质，探究ADRA方法用于化合物致敏性评价的准确度，并在10种物质中随机选取几种物质采用国内已转化验证过的方法直接反应多肽法（DPRA）对结果进行验证。结果表明，10种物质致敏性判定结果符合样品自身致敏性，认定ADRA致敏性判定准确度较好，可作为皮肤致敏AOP的第一个关键事件替代实验方法。关键词：皮肤致敏性；替代实验；氨基酸衍生化反应（ADRA）中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1001-1803（2023）02-0157-08159第 2 期开发与应用沈 立，等：化妆品原料的过敏性体外方法氨基酸衍生化反应法（ADRA）方法转化与验证 1.2.2 试液配制1）pH8.0磷酸盐缓冲液：取0.18 g无水磷酸氢二钠与4.02 g无水磷酸二氢钠溶于300 mL蒸馏水，每300 mL缓冲液加入1 mL的0.1 mmol/L EDTA溶液，混匀，所得溶液pH为7.98.1，使用前检查pH。pH10.2磷酸盐缓冲液：取4.26 g无水磷酸二氢钠溶于286 mL蒸馏水，加入14 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，每300 mL缓冲液加1 mL的0.1 mmol/L EDTA溶液。混匀，所得溶液pH为10.110.3，使用前检查pH。2）反应固定液（TFA）：1 mL三氟乙酸+40 mL水于50 mL离心管中，得到2.5%的TFA水溶液。3）氨基酸衍生物储备液：取10 mL pH8.0磷酸盐缓冲液加入NAC标准品瓶中，NAL则加入10 mL pH10.2缓冲液，振荡溶解，得到6.667 mol/L的NAC/NAL储备液，储备液在-80 下冷冻保存，存放时间不超过 6个月，每次使用应验证其稳定性。4）NAC的线性系列标准溶液的稀释溶剂：取15 mL pH8.0缓冲液（NAL线性稀释溶剂则取15 mL pH10.2缓冲液）于50 mL离心管，加1 mL水、100 L TFA、3.9 mL乙腈，振荡混匀，临用现配。5）受试化合物溶液：取测试物适量，加适当溶剂（乙腈、水、丙酮，单用或者混合使用，必要时可以使用少量DMSO）制成1 mmol/L的溶液。6）阳性对照溶液：取苯乙醛适量，加乙腈制成溶 剂对照中氨基酸衍生物峰面积均值样 品氨基酸衍生物峰面积均值氨基酸衍生物消耗值=（1-100%）1 mmol/L的溶液，临用现配。pH8.0与pH10.2分别是NAC与NAL在反应液中与受试物结合率最高的pH值4，加EDTA是防止金属离子影响NAC/NAL稳定性。反应固定液防止反应继续进行，反应完成后加入。其中4）项是用于制备标准曲线系列溶液。1.2.3 样品溶液1）共洗脱对照（专属性对照）：150 L磷酸盐缓冲液+50 L受试物溶液。2）参比溶液A和B：即空白对照。取1.2.2试液配制项下3）NAC储备液150 L+50 L乙腈，混匀既得；参比溶剂A平行3份，B 6份。NAL的操作步骤一致。3）参比溶液C：即溶剂对照。取1.2.2试液配制项下3）NAC储备液150 L+50 L溶解受试物的溶剂，平行3份。本实验当中，氯胺T与咪唑烷基脲溶剂为水，棕榈酰氯溶剂为丙酮。其余物质溶剂均为乙腈。故取150 L NAC储备液+50 L水，混匀既得，平行制备 3份。取150 L NAC储备液+50 L丙酮，混匀既得，平行制备3份。乙腈溶剂对照因为与上一项空白对照相同，故不重复配制。4）阳性对照溶液：150 L NAC+试液配制项下6）苯乙醛乙腈溶液50 L，混匀既得。平行制备3份。NAL阳性对照的操作步骤一致。5）供试品溶液：150 L NAC+1.2.2试液配制项下5）受试物溶液，平行3份。NAL供试品样品的操作步骤一致。6）标准线性溶液：300 L浓度6.667 mol/L NAC储备液加入1.5 mL离心管中，加入20 L水、2 L TFA、78 L乙腈，得5 mol/L的标准溶液（std7）。取std7溶液，用1.2.2试液配制项下4）稀释溶剂逐步稀释到下表1浓度。std1为稀释溶剂，进样前