黄丝郁金及其醋炙品治疗原发...物质基础及作用机制预测研究_彭颖.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金青年基金项目（）；中国博士后科学基金会项目（）；成都中医药大学西南特色中药资源重点实验室开放研究基金项目（，）通信作者陈志敏，博士，：；许润春，副教授，：作者简介 彭颖，硕士研究生，：制剂与炮制 黄丝郁金及其醋炙品治疗原发性痛经的物质基础及作用机制预测研究彭颖，东宝花，蒋云秀，吴杰，曹马怡洁，胡昌江，许润春，陈志敏，（成都中医药大学 药学院，四川 成都；成都中医药大学 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都；成都中医药大学 四川省非物质文化遗产保护传承基地，四川 成都；国家中医药管理局中药配方颗粒质量与疗效评价重点研究室，四川 成都）摘要 该研究采用液质联用技术对黄丝郁金、醋黄丝郁金饮片和给药血清的化学成分进行分析，结合数据库二级谱图及文献，分析鉴定黄丝郁金和醋黄丝郁金的化学成分及入血成分。检索原发性痛经的疾病靶点，对入血成分和疾病的交集靶点进行蛋白质互作网络分析、和 通路富集分析，并构建入血成分靶点通路图，使用 软件对核心成分和核心靶点进行分子对接验证。从黄丝郁金和醋黄丝郁金中鉴定出 个化学成分，并初步鉴定出 个入血成分，结合网络药理学得到原莪术烯醇、对羟基苯甲酸异丁酯、阿魏酸、莪术奥酮二醇等 个核心成分，、等 个核心靶点，核心靶点主要分布在心、肝、子宫及平滑肌等组织器官。分子对接结果显示核心成分与核心靶点结合性较好，推断黄丝郁金和醋黄丝郁金可能通过雌激素、卵巢类固醇生成、等信号通路发挥对原发性痛经的治疗作用。该实验初步阐明了黄丝郁金、醋黄丝郁金的入血成分及其作用机制，为深入研究黄丝郁金及醋黄丝郁金药效物质基础及临床应用提供了参考。关键词 黄丝郁金；醋炙；原发性痛经；网络药理学；分子对接 ，（，；，；，；，）（），（），（）年 月第 卷第 期.，.，（），（，）（），（），（），（），（），；：.原发性痛经是指月经来潮前后，周期性出现的小腹部疼痛，且盆腔未发现器质性病变为主的一类疾病。中医认为肝气郁滞，疏泄失司，气机不畅，就会影响血液的运行形成瘀血，导致胞宫瘀阻，不通则痛，即为痛经。原发性痛经治疗以活血化瘀、疏肝理气为主，郁金既能行气又能活血，常见于中医治疗痛经的方剂中。黄丝郁金来源于姜科植物姜黄 的干燥块根，是中国药典中郁金的 个来源之一，主产于四川。课题组前期证实黄丝郁金具有活血化瘀、行气、止痛作用，并且醋炙后黄丝郁金活血化瘀止痛作用有所增强。中药药效物质基础和作用机制研究是中药深入开发和应用的重要内容，药物被吸收进入血液进而发挥作用，入血成分可以为阐明药效物质基础提供依据，网络药理学是预测其作用机制的有效手段。目前对姜黄属其他药材的入血成分及作用机制预测已有研究，但尚无文献对黄丝郁金进行全面、系统的分析。基于此，本研究采用液质联用技术对黄丝郁金、醋黄丝郁金化学成分、入血成分进行分析鉴定，采用网络药理学研究方法构建“成分疾病靶点通路”相互作用网络，预测黄丝郁金及其醋炙品治疗原发性痛经的靶点及其可能的作用机制，最后采用分子对接技术验证活性成分与靶点的结合作用。材料万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），型高速离心机（上海安亭科学仪器厂），型多功能粉碎机（合肥荣事达小家电有限公司），型多功能炒货机（常州市金坛迈斯机械有限公司），型超声波清洗机（东菀市洁康超声波设备有限公司），超高效液相色谱仪（美国 公司），型高分辨质谱（美国 公司）。甲醇（批号，成都市科隆化学品有限公司），甲醇、乙腈（级，），甲酸（级，），纯净水华润怡宝饮料（中国）有限公司，米醋（批号，江苏恒顺醋业股份有限公司）。黄丝郁金饮片购于四川新荷花中药饮片有限公司，批号，产地四川，经成都中医药大学药学院胡昌江教授鉴定为姜科植物姜黄 的块根。健康的 雌性大鼠 只，级，体质量（），由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号（川）。方法.黄丝郁金及醋黄丝郁金入血成分分析.色谱质谱条件色谱柱 （.，.）；柱温；流动相：相为.甲酸水，相为.甲酸乙腈；梯度洗脱（.，；.，；.，；.，；.，；.，；，；，；，）；流速.；进样量 。型质谱仪能够在控制软件彭颖等：黄丝郁金及其醋炙品治疗原发性痛经的物质基础及作用机制预测研究（，美国 公司）控制下基于 功能进行一级、二级质谱数据采集。参数如下：鞘气流速，辅助气流速，离子传输管温度 ，蒸发器温度 ，分辨率，分辨率 ，碰撞能量，归一化模式；喷雾电压.（正）或 （负）。.醋黄丝郁金的制备根据课题组前期条件，取净黄丝郁金 ，加米醋 搅拌均匀，保鲜膜封口闷润 ，在 下炒制 ，取出放凉，过筛，即得。.黄丝郁金、醋黄丝郁金供试液制备称取生、醋黄丝郁金样本 ，加入 甲醇；涡旋 ，匀浆 ，冰水浴超声 ；静置 后将样本 ，离心 ；取出上清过.滤膜上机检测。.黄丝郁金、醋黄丝郁金体内分析样品制备称取黄丝郁金、醋黄丝郁金饮片各 ，粉碎，过 号筛，置研钵中加水研磨，制成质量浓度为.的混悬液，待用。将 大鼠随机分成 组，每组 只，禁食 ，自由饮水，给药组按.灌胃黄丝郁金混悬液，空白组给同体积蒸馏水。连续给药 ，末次给药后.，眼眶后静脉丛取血，静置 ，离心 ，取上清液，于 储存备用。取 血清样本，加入 盐酸（）；涡旋 ，静置 ；重复涡旋静置 次后，加入.乙腈；涡旋 ，离心 ，取上清 氮吹干燥；加入 甲醇复溶，涡旋 ，离心；取 上清到进样瓶中上机检测。.数据分析使用 软件将质谱原始导入。进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，利用自建二级质谱数据库及相应裂解规律匹配法对含有 数据的峰进行物质鉴定。.网络药理学研究.入血成分靶点获取及疾病靶点检索采用（：）对黄丝郁金、醋黄丝郁金入血成分靶点进行预测，基于（：）、（：）数据库，以“”为关键词检索，收集原发性痛经靶点疾病靶点。.网络构建及其核心靶点的筛选 利用 .（：），分别输入成分和疾病的作用靶点，绘制 图，找到其中的交集靶点作为黄丝郁金、醋黄丝郁金治疗原发性痛经的潜在作用靶点。将潜在靶基因上传至（：）得到潜在靶基因间蛋白互作（，）网络，在 中设置“”“”选项分别为“”和“（.）”。将潜在靶基因间蛋白互作网络导入，然后通过 软件中 插件对每个靶点进行拓扑参数分析，通过 个拓扑参数度值、介数中心性、接近中心性来筛选核心靶点。.核心靶点的器官定位分析将核心靶点导入 数据库（：），物种选择，得到相关基因在不同组织器官中的基因表达数据集，使用 网站（：）生成黄丝郁金及醋黄丝郁金入血成分治疗痛经核心靶点的器官定位表达热图，热图中颜色越深表示基因在该组织中表达和分布越多。.和 通路富集分析通过 数据库将黄丝郁金、醋黄丝郁金治疗原发性痛经的靶点 格式转换为 格式，导入到 云平台，限定物种为“”，类型为“基因”，利用 平台作图工具中的动态 富集分析及动态 富集分析软件对黄丝郁金、醋黄丝郁金治疗原发性痛经的靶点进行 功能注释分析和 通路富集分析，筛出核心通路，将满足 的结果以气泡图形式呈现，并根据富集因子（）分析核心通路的富集程度，以探究黄丝郁金、醋黄丝郁金治疗原发性痛经可能的作用机制。.“成分核心靶点通路”网络构建将核心靶点及其涉及的入血成分与前 条信号通路及其相关靶点导入 软件，构建“成分核心靶点通路”网络图。运用 插件对网络中的成分节点进行拓扑分析，进一步筛选出度值排名靠前的关键核心成分和靶点。.分子对接黄丝郁金治疗原发性痛经排名前 的关键核心成分和筛选后的 个关键核心靶点进行分子对接。在 中下载核心成分的 年 月第 卷第 期.，.，结构文件，在（：）中下载核心靶点的 蛋白结构文件。对关键成分和关键作用靶点的 结构进行去水、加氢，转换成 格式，通过 软件完成分子对接分析，使用 网站（：）做分子对接结果热图。结果.黄丝郁金入血成分分析.黄丝郁金、醋黄丝郁金化学成分分析 采用液质联用技术对黄丝郁金、醋黄丝郁金供试品溶液进行检测分析，总离子流图见图。利用自建二级质谱数据库及相应裂解规律匹配法对含有 数据的峰进行物质鉴定，结合文献数据比对共鉴定出 个化合物，各成分的信息见表。姜黄素和倍半萜类是黄丝郁金的主要成分，黄丝郁金、醋黄丝郁金中共鉴定出 个倍半萜类、个姜黄素类化合物。醋炙后，姜黄素类化合物总量降低，姜黄素含量降低，而去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素含量升高，二甲基姜黄素含量不变。与生品相比，醋炙品中倍半萜类成分总量降低，大部分倍半萜类如莪术二醇、莪术醇、原莪术烯醇、吉马酮等含量降低，莪术烯醇含量升高。正离子模式生黄丝郁金；正离子模式醋黄丝郁金；负离子模式生黄丝郁金；负离子模式醋黄丝郁金。图 黄丝郁金及醋黄丝郁金总离子流图.化学成分的鉴定 从黄丝郁金、醋黄丝郁金供试液中鉴定出 个化学成分，分别以化合物、和 为例说明推测过程。化合物 在负离子模式下，其准分子离子峰 .脱掉 个，得到碎片离子 .，再 脱 掉 个，得到基峰 .，参考阿魏酸碎片离子（）与负离子模式下二级质谱图，见图。化合物 在正离子模式下，其准分子离子峰 .脱掉 个，得到碎片离子 .，再脱掉 个，得到基峰 .，参考吉马酮碎片离子与正离子模式下二级质谱图，见图。化合物 在正离子模式下，其准分子离子峰 .，特征碎片离 子 有.、.、.，.脱去产生 .，参考姜黄素碎片离子（）与正离子模式下二级质谱图，见图。.生黄丝郁金及醋黄丝郁金入血成分分析对空白血清、黄丝郁金含药血清、醋黄丝郁金含药血清进行成分鉴定与分析，过程与饮片化学成分鉴定相同，初步鉴定得 个入血成分，均为黄丝郁金原型成分，黄丝郁金、醋黄丝郁金入血成分结果见表。黄丝郁金与醋黄丝郁金含药血清中化学成分基本一致，但含量上存在差异。醋黄丝郁金入血成分中莪术二醇含量较生品低，莪术醇、原莪术烯醇含量较生品高。彭颖等：黄丝郁金及其醋炙品治疗原发性痛经的物质基础及作用机制预测研究 表 黄丝郁金及醋黄丝郁金化学成分 相对分子质量分子式实测值误差 离子碎片鉴定生品 醋炙品.、.、.、.麝香草酚.、.松柏醛.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.樟脑.香草酸.咖啡酸.、.香兰素.、.、.肉桂酸.、.阿魏酸.、.、.、.松柏苷.、.，三 甲 氧基肉桂酸甲酯.、.、.、.、.对羟基苯甲酸.，二 甲 氧 基肉桂酸.、.、.、.，（），.、.、.、.、.、.、.吉马酮.、.、.、.、.，双（羟基苯基）庚 烷，二醇.、.，三 甲 氧基肉桂酸.莪术奥酮二醇.、.、.对羟基苯甲酸异丁酯.、.、.对甲基肉桂酸.、.、.、.青蒿酸.、.、.、.、.、.、.、.去氢木香内酯.年 月第 卷第 期.，.，续表 相对分子质量分子式实测值误差 离子碎片鉴定生品 醋炙品.莪术二醇.覆盆子酮.、.、.、.、.双脱氧基姜黄素.、.、.、.、.、.双氢青蒿素.、.、.、.、.、.、.、.、.原莪术烯醇.、.、.、.、.、.、.蓬莪术环氧酮.、.、.芥子醛.、.、.桉脂素.莪术烯醇.去甲氧基姜黄素.、.二氢亚麻酸.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.邻苯二甲酸正二丁酯.、.、.、.、.、.、.姜黄素.、.、.、.亚麻酸.、.、.、.、.、.、.姜烯酚.、.、.、.、.葎草烯.、.、.、.、.莪术二酮.、.二甲基姜黄素.亚麻酸甘油酯.、.、.、.莪术醇.、.亚油酸.彭颖等：黄丝郁金及其醋炙品治疗原发性痛经的物质基础及作用机制预测研究图 阿魏酸（）负离子模式下，吉马酮（）、姜黄素（）正离子模式下二级质谱图.（），（），（）.网络药理学.作用靶点预测除了质量分数低于.的 个成分，将剩余的 个入血成分在 检索，得到入血成分靶点 个，将来自、数据库的原发性痛经靶点删除重复项后得到疾病靶点，共得到靶点 个。.网络构建及核心靶点的筛选将化合物靶点、疾病靶点制作 图，获得交集靶点 个，见图。通过 数据库，将筛选出的 个交集靶点输入，利用 .设置节点的大小、颜色随度值大小变化，构建 网络图，见图。利用 软件中 插件，对各靶点网络特征进行分析，以度值中位数、介数中心性中位数、接近中心性 倍中位数，筛选出前 个关 键 靶 点 为、，可能为黄丝郁金及醋黄丝郁金治疗痛经作用的关键靶点。醋炙后含