黄芪甲苷Ⅳ通过激活Nrf-...激介导的人SY5Y细胞凋亡_于婧文.pdf

论论著著文文章章编编号号：（）黄黄芪芪甲甲苷苷通通过过激激活活 信信号号通通路路抑抑制制氧氧化化应应激激介介导导的的人人 细细胞胞凋凋亡亡于于婧婧文文，郭郭敏敏芳芳，杨杨鹏鹏伟伟，李李艳艳花花，刘刘春春云云，宋宋丽丽娟娟，柴柴智智，尉尉杰杰忠忠，马马存存根根，（山山西西大大同同大大学学脑脑科科学学研研究究所所 中中枢枢神神经经炎炎性性变变性性疾疾病病新新药药创创制制省省市市共共建建山山西西省省重重点点实实验验室室培培育育基基地地，山山西西 大大同同 ；山山西西中中医医药药大大学学国国家家中中医医药药管管理理局局多多发发性性硬硬化化益益气气活活血血重重点点研研究究室室 神神经经生生物物学学研研究究中中心心，山山西西 晋晋中中 ；山山西西医医科科大大学学生生理理学学系系，山山西西 太太原原 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：国国家家自自然然科科学学基基金金（）；山山西西省省应应用用基基础础研研究究计计划划（，）；山山西西省省黄黄芪芪资资源源产产业业化化及及产产业业国国际际化化协协同同创创新新中中心心项项目目（）；大大同同市市应应用用基基础础研研究究计计划划（）作作者者简简介介：于于婧婧文文（），女女，山山西西左左云云人人，高高级级实实验验师师，硕硕士士 ：；：通通讯讯作作者者，马马存存根根，：摘摘 要要 目目的的 探探讨讨黄黄芪芪甲甲苷苷（）对对 诱诱导导的的人人 细细胞胞氧氧化化应应激激损损伤伤以以及及细细胞胞凋凋亡亡的的保保护护作作用用及及机机制制。方方法法体体外外培培养养 细细胞胞，用用 诱诱导导建建立立氧氧化化应应激激模模型型，分分为为 组组、模模型型组组和和 组组。采采用用四四甲甲基基偶偶氮氮唑唑蓝蓝（）法法测测定定细细胞胞活活力力，原原位位末末端端转转移移酶酶标标记记技技术术（）检检测测细细胞胞凋凋亡亡。取取各各组组细细胞胞的的上上清清液液，比比色色法法测测定定丙丙二二醛醛（）、超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（）和和谷谷胱胱甘甘肽肽（）的的含含量量。免免疫疫荧荧光光细细胞胞化化学学染染色色法法检检测测裂裂解解型型胱胱天天蛋蛋白白酶酶 （）和和核核因因子子 相相关关因因子子（）的的表表达达和和分分布布。法法检检测测细细胞胞凋凋亡亡蛋蛋白白 淋淋巴巴细细胞胞瘤瘤因因子子（）、相相关关 蛋蛋白白（）和和 ，以以及及氧氧化化应应激激信信号号通通路路 在在胞胞质质内内和和细细胞胞核核内内的的表表达达及及下下游游蛋蛋白白血血红红素素加加氧氧酶酶 （）的的蛋蛋白白水水平平。结结果果 对对处处于于氧氧化化应应激激损损伤伤状状态态下下的的 细细胞胞具具有有保保护护作作用用，能能够够减减少少 含含量量，增增加加 和和 的的含含量量。增增加加 表表达达，减减少少 表表达达，的的比比值值与与 模模型型组组相相比比显显著著升升高高，同同时时抑抑制制 的的表表达达。促促进进 核核转转位位，增增加加下下游游抗抗氧氧化化蛋蛋白白 的的表表达达。结结论论 可可通通过过激激活活 信信号号通通路路，促促进进 核核转转位位，增增加加 的的表表达达，调调节节氧氧化化 抗抗氧氧化化平平衡衡，提提高高机机体体抗抗氧氧化化水水平平，保保护护细细胞胞免免受受氧氧化化损损伤伤和和减减少少细细胞胞凋凋亡亡。关关键键词词 黄黄芪芪甲甲苷苷（）；核核因因子子 相相关关因因子子（）；血血红红素素加加氧氧酶酶 （）；氧氧化化应应激激 中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 ，；，；，：（），（）（），（）（）（）（）（），（），（）细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009476 ，（）；（）；（）；氧氧化化应应激激是是多多种种疾疾病病致致病病的的重重要要因因素素之之一一。由由氧氧自自由由基基引引起起的的氧氧化化应应激激反反应应在在耗耗能能高高的的中中枢枢神神经经系系统统（，）内内更更易易发发起起攻攻击击。衰衰老老、遗遗传传易易感感、线线粒粒体体功功能能障障碍碍、自自由由基基产产生生和和环环境境毒毒素素等等众众多多因因素素 都都可可以以引引起起氧氧化化应应激激反反应应。中中氧氧化化应应激激反反应应影影响响多多种种酶酶和和信信号号分分子子 ，并并且且参参与与疾疾病病的的发发生生发发展展，例例如如引引起起线线粒粒体体代代谢谢异异常常 、淀淀粉粉样样蛋蛋白白（，）沉沉积积 、金金属属离离子子失失衡衡 ，、神神经经元元微微管管结结合合相相关关蛋蛋白白 （，）磷磷酸酸化化 、炎炎性性反反应应 ，等等一一系系列列的的级级联联反反应应，最最终终出出现现神神经经元元的的丢丢失失。心心脑脑血血管管疾疾病病、神神经经退退行行性性疾疾病病、代代谢谢疾疾病病和和炎炎症症疾疾病病 等等都都与与氧氧化化应应激激反反应应有有关关。既既然然氧氧化化应应激激作作为为疾疾病病诱诱因因之之一一，那那么么通通过过抗抗氧氧化化治治疗疗是是否否可可以以加加以以纠纠正正，是是众众多多学学者者关关注注的的热热点点。从从传传统统的的抗抗氧氧化化剂剂如如叶叶酸酸、维维生生素素（、和和烟烟酸酸）、硒硒以以及及 胡胡萝萝卜卜素素等等，到到新新型型的的抗抗氧氧化化分分子子材材料料纳纳米米颗颗粒粒，从从药药物物帕帕罗罗西西汀汀、辛辛伐伐他他汀汀、亚亚甲甲蓝蓝等等到到天天然然植植物物中中的的抗抗氧氧化化提提取取成成分分等等 ，众众多多研研究究表表明明，补补充充抗抗氧氧化化剂剂在在疾疾病病的的治治疗疗中中也也发发挥挥着着重重要要作作用用。天天然然中中草草药药中中的的黄黄酮酮类类、酚酚类类、萜萜烯烯类类化化合合物物都都具具有有清清除除自自由由基基，抗抗氧氧化化和和神神经经保保护护特特性性 ，这这对对于于食食品品和和医医药药工工业业具具有有重重要要的的意意义义。黄黄芪芪甲甲苷苷（，）是是传传统统的的益益气气中中药药黄黄芪芪的的主主要要活活性性成成分分之之一一，在在抗抗炎炎、免免疫疫调调节节和和细细胞胞保保护护等等方方面面发发挥挥重重要要作作用用，尤尤其其在在抗抗氧氧化化和和清清除除自自由由基基方方面面表表现现更更为为突突出出 。研研究究表表明明，联联合合迷迷走走神神经经电电刺刺激激能能有有效效减减轻轻脑脑缺缺血血再再灌灌注注大大鼠鼠神神经经功功能能缺缺损损，抑抑制制神神经经细细胞胞凋凋亡亡、氧氧化化应应激激及及炎炎症症反反应应等等 。还还可可以以增增加加核核受受体体过过氧氧化化物物酶酶体体增增殖殖物物 激激 活活 受受 体体 （，）的的活活性性，抑抑制制 分分泌泌酶酶 （）即即 位位点点淀淀粉粉样样前前体体蛋蛋白白裂裂解解酶酶（，）的的活活性性，从从而而减减少少转转基基因因小小鼠鼠脑脑内内神神经经炎炎性性斑斑块块的的形形成成和和 的的聚聚集集 。对对氧氧化化应应激激作作用用下下的的神神经经元元影影响响鲜鲜有有报报道道。鉴鉴于于此此，我我们们推推测测 可可能能对对氧氧化化应应激激损损伤伤的的神神经经元元 细细胞胞同同样样有有保保护护作作用用。本本研研究究以以 诱诱导导的的人人 细细胞胞为为神神经经细细胞胞氧氧化化应应激激模模型型，进进一一步步研研究究 对对氧氧化化应应激激损损伤伤的的保保护护机机制制，阐阐明明其其作作用用在在核核因因子子 相相关关因因子子 血血红红素素加加氧氧酶酶（，）信信号号通通路路上上的的核核转转位位情情况况和和蛋蛋白白表表达达的的情情况况。材材料料和和方方法法 材材料料 神神经经母母细细胞胞瘤瘤细细胞胞株株购购自自国国家家实实验验细细胞胞资资源源共共享享平平台台。（纯纯度度 ）和和羧羧甲甲纤纤维维素素钠钠购购自自上上海海阿阿拉拉丁丁生生化化公公司司；原原位位末末端端转转移移酶酶标标记记技技术术（，）细细胞胞凋凋亡亡检检测测试试剂剂盒盒、丙丙二二醛醛（，）、超超氧氧化化物物歧歧化化 酶酶（，）、谷谷 胱胱 甘甘 肽肽（，）、细细胞胞核核和和细细胞胞蛋蛋白白提提取取试试剂剂盒盒、二二辛辛可可宁宁酸酸（，）蛋蛋白白质质定定量量检检测测试试剂剂盒盒均均购购自自碧碧云云天天生生物物公公司司；兔兔抗抗 抗抗体体和和小小鼠鼠抗抗 抗抗体体购购自自 公公司司；兔兔抗抗裂裂解解型型胱胱天天蛋蛋白白酶酶 （，）抗抗体体、兔兔抗抗 细细胞胞淋淋巴巴瘤瘤因因子子 （，）抗抗体体、兔兔抗抗 相相关关 蛋蛋白白（，）抗抗体体和和兔兔抗抗 肌肌动动蛋蛋白白（）抗抗体体均均购购自自 公公 司司；辣辣 根根 过过 氧氧 化化 物物 酶酶（，）标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 、标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 、标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 购购自自 公公司司；高高糖糖 和和胎胎牛牛血血清清（，）购购自自 公公司司；青青霉霉素素、链链霉霉素素和和谷谷氨氨酰酰胺胺购购自自 公公司司；噻噻唑唑蓝蓝（，）和和二二甲甲基基亚亚砜砜（，）购购自自 公公司司；牛牛血血清清白白蛋蛋白白（，）购购自自 公公司司。方方法法 细细胞胞培培养养 将将 细细胞胞培培养养于于 培培养养皿皿中中，用用 含含 、青青 霉霉 素素、链链霉霉素素、谷谷氨氨酰酰胺胺的的 培培养养细胞与分子免疫学杂志（），（）基基培培养养，置置于于 、的的细细胞胞培培养养箱箱中中培培养养。隔隔天天换换液液 次次，至至细细胞胞汇汇合合度度约约 ，用用 的的胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化并并传传代代，选选取取对对数数生生长长期期细细胞胞进进行行以以下下实实验验。法法检检测测 细细胞胞活活力力确确定定 最最佳佳处处理理浓浓度度 细细胞胞活活力力实实验验分分为为 组组和和 处处理理的的 组组，组组 细细胞胞分分别别采采用用（、）进进行行处处理理（溶溶剂剂为为 羧羧甲甲纤纤维维素素钠钠），处处理理的的 组组先先加加（、），培培 养养 后后，再再 用用 处处理理，继继续续培培养养 。每每孔孔加加 ，继继续续孵孵育育 后后，离离心心 ，弃弃上上清清液液。每每孔孔加加 ，振振荡荡 ，使使结结晶晶全全部部溶溶解解，酶酶标标仪仪 波波长长测测定定（）值值。细细胞胞活活力力 （样样本本 空空白白）（对对照照 空空白白）。细细胞胞分分组组及及给给药药 实实验验分分为为 组组、模模型型组组和和 联联合合 组组。模模型型组组加加入入 的的 孵孵育育 （根根据据既既往往文文献献 和和 实实验验结结果果），建建立立神神经经细细胞胞氧氧化化应应激激损损伤伤模模型型，联联合合 组组在在加加入入 之之前前 ，加加入入 （根根据据 实实验验结结果果确确定定的的处处理理浓浓度度）共共孵孵育育 。法法检检测测 细细胞胞凋凋亡亡 将将 细细胞胞按按 个个 的的细细胞胞数数接接种种于于放放有有细细胞胞爬爬片片的的 孔孔板板中中，加加药药处处理理 后后弃弃细细胞胞上上清清液液，用用 的的多多聚聚甲甲醛醛固固定定 ，洗洗 次次，用用含含 的的 ，室室温温孵孵育育 ，洗洗 次次。按按照照 试试剂剂盒盒说说明明配配制制 检检测测工工作作液液（酶酶与与荧荧光光标标记记液液按按体体积积比比 ），每每孔孔加加 检检测测液液，避避光光孵孵育育 ，洗洗 次次。最最后后用用含含 染染料料的的抗抗荧荧光光淬淬灭灭封封片片液液封封片片，在在 荧荧 光光 显显 微微 镜镜 下下 观观 察察，的的 激激 发发 波波 长长 为为 ，发发射射波波长长为为 。数数出出视视野野下下阳阳性性细细胞胞的的数数量量（红红色色荧荧光光）和和细细胞胞总总数数量量（蓝蓝色色荧荧光光），计计算算细细胞胞凋凋亡亡率率，细细胞胞凋凋亡亡率率（）阳阳性性细细胞胞数数 细细胞胞总总数数 。试试剂剂盒盒检检测测 细细胞胞 、含含量量 取取各各组组处处理理 后后的的 细细胞胞，将将细细胞胞在在 下下充充分分裂裂解解，离离心心 。取取上上清清作作为为待待测测样样品品，严严格格按按照照对对应应试试剂剂盒盒说说明明书书操操作作测测定定裂裂解解液液 、含含量量。细细胞胞的的细细胞胞质质和和细细胞胞核核蛋蛋白白的的分分离离取取各各组组处处理理 后后的的 细细胞胞，清清洗洗后后用用细细胞胞刮刮刀刀刮刮下下细细胞胞；转转移移到到 管管，离离心心收收集集细细胞胞。