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细胞培养常用技术细胞培养常用技术 Cell 第一类研究方法第一类研究方法 形态观察技术形态观察技术 第二类研究方法第二类研究方法 生物化学分析技术生物化学分析技术 第三类研究方法第三类研究方法 V 细胞生理学技术细胞生理学技术 第四类研究方法第四类研究方法 其它实验技术其它实验技术 第一节 细胞形态结构观察技术 目镜 物镜 集光器 载物台 光源 1.1.普通光镜的结构普通光镜的结构:（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜 一、光学显微镜一、光学显微镜 2.2.普通光镜的成像原理普通光镜的成像原理 2 2 图像图像 样品样品 光线光线 聚光器聚光器 物镜物镜 光学显微镜的光路图光学显微镜的光路图 分辨率分辨率 分辨率指指显微镜能将近邻的两个质点分辨显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离，通常是用相邻两点间的距离来表示来表示.与数值孔径的关系：D=0.61/NA=0.61/N sin(/2)D为分辨率;为光波波长;要提高分辨率，可采取使用短波长光源、采用介质折射率高的袖浸系、增大孔径角以提高NA值等措施。倒置显微镜倒置显微镜 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明细胞透明度大，折光性强，轮廓不清度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物有时细胞表面及周围出现丝絮状物。细胞的生长状态 BMSCs 培养细胞的生长过程培养细胞的生长过程 Anip973 在普通光学显微镜下，细胞结构呈在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状半透明状，不易看清。，不易看清。往往将标本切片往往将标本切片进行进行染色染色提提高可辨程度高可辨程度。移动臂移动臂 蜡或树脂包埋的样品蜡或树脂包埋的样品 切片用钢刀切片用钢刀 样品切片蜡带样品切片蜡带 伸展在盖玻片和伸展在盖玻片和 载玻片之间的切片载玻片之间的切片 切片机切片机 染染色色的的原原理理 未染色未染色 已染色已染色(二二)暗视野显微镜暗视野显微镜 这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。中央遮光板中央遮光板 暗视野聚光器的设计原理暗视野聚光器的设计原理 视野的背景黑视野的背景黑 物体的边缘亮物体的边缘亮 利用这种显微镜能见到小至利用这种显微镜能见到小至5 5nmnm的质点的质点，分辨率比普通显微镜高了分辨率比普通显微镜高了4040倍倍，有一些细胞有一些细胞器器，如核如核、线粒体线粒体，均清晰可见均清晰可见。(三三)相差显微镜相差显微镜 由荷兰物理学家由荷兰物理学家F F.Zernike(Zernike(19321932)发明发明：提高了活细胞结构的反差提高了活细胞结构的反差，从而解决了对从而解决了对活细胞观察的难题活细胞观察的难题。获诺贝尔物理奖获诺贝尔物理奖(1953)(1953)(phase contrast microscope)(phase contrast microscope)光通过不同密度物质时滞留的时间光通过不同密度物质时滞留的时间 不同，利用相差板，将不同，利用相差板，将厚度厚度的差别转的差别转 化成化成明暗明暗的差别，增加反差。的差别，增加反差。特 点：在 聚 光 器 或 光 源 上 加 了 一：在 聚 光 器 或 光 源 上 加 了 一 环 形 光 阑环 形 光 阑(annular(annular diaphragm),diaphragm),在物镜中加了一在物镜中加了一环形相板环形相板(annular(annular phasephase plate)plate)。相差显微镜的构造相差显微镜的构造:上有一环形区上有一环形区，制成制成凹槽凹槽或或凸起凸起（亦可涂上特殊物质亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度环形区的设计深度（或高度或高度）恰好可恰好可使通过此区的光线提前使通过此区的光线提前或延后或延后1 1/4 4光程差光程差。环形光阑环形光阑 环形相板环形相板 使透过聚光器的光使透过聚光器的光线形成线形成空心光锥空心光锥，焦聚到标本上焦聚到标本上。相相差差显显微微镜镜的的构构造造 相差显微镜相差显微镜 的光路图解的光路图解 根据设计根据设计，只有未透过只有未透过标本的直射光可通过相标本的直射光可通过相板环形区板环形区，而透过标本而透过标本的偏折光则由相板其他的偏折光则由相板其他部分通过部分通过。两组光线和两组光线和轴后发生干涉现象轴后发生干涉现象。两组光线合轴后光波相减两组光线合轴后光波相减，振幅变小振幅变小，形形成成暗反差（正反差正反差）结构比周围介质更加变暗结构比周围介质更加变暗。未透过标本的未透过标本的直射光直射光（通过相板环形区通过相板环形区）与与透透过标本的过标本的偏折光偏折光（由相板其他部分通过由相板其他部分通过）和轴和轴后发后发生生干涉干涉：S S-D D S S D D 如果为如果为凹形相板：通过样品的光线延后通过样品的光线延后1/4 1/4 -1/41/4 -1/4 1/4 则两组光波相加则两组光波相加，振幅加大振幅加大，形成形成亮反差（负反差负反差）标本结构比周围介质更加变亮标本结构比周围介质更加变亮。S+DS+D S S D D 如果为如果为凸性相板凸性相板：由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在在相差显微镜下显示出不同的明暗度相差显微镜下显示出不同的明暗度。-1/41/4 +1/4+1/4 显微镜观察 相差显微镜相差显微镜 （phase contrast microscopephase contrast microscope）活细胞对光线是透明的，光线通活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。经染色的活细胞。2020世纪世纪3030年代年代 荷兰荷兰 ZernikeZernike 原理：原理：利用光的衍射和干涉特性，利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。从而使标本的各种结构变得清晰。相差显微镜观察活细胞的步骤如下：调整好相差显微镜调整好相差显微镜 观察瓶皿准备观察瓶皿准备 调光调光 调焦与摄影调焦与摄影 细胞观察细胞观察 (四四)微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜 NomarskiNomarski (19521952)在相差显微镜原理的基础在相差显微镜原理的基础上发明的：又称上发明的：又称NomarskiNomarski相差显微镜相差显微镜，其优点其优点是是能显示结构的三维立体投影影像能显示结构的三维立体投影影像。(differential interference(differential interference contrast(DIC)microscope)contrast(DIC)microscope)与相差显微镜相比与相差显微镜相比，其标本可略厚一其标本可略厚一点点，折射率差别更大折射率差别更大。DICDIC显微镜首先显微镜首先DICDIC利用的是利用的是偏振光偏振光。此外此外，除了物镜外除了物镜外，还增加了四个光学还增加了四个光学组件：组件：偏振器偏振器(polarizer)(polarizer)、DICDIC棱镜棱镜、DICDIC滑行器滑行器和和检偏器检偏器(analyzer)(analyzer)。DICDIC显微镜使细胞的细微结构立体感特显微镜使细胞的细微结构立体感特别强别强，适合于显微操作适合于显微操作。目前像目前像基因注入基因注入、核移植核移植等生物工程的显微操作常在这种显等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行微镜下进行。DIC显微镜显微镜 暗视野显微镜暗视野显微镜 相差显微镜相差显微镜 普通显微镜普通显微镜 荧光显微镜的成象原理荧光显微镜的成象原理(五五)荧光显微镜荧光显微镜 分裂细胞的分裂细胞的 免疫荧光图像免疫荧光图像 不同荧光染料不同荧光染料 标记标记 抗抗 体体 特异性结合特异性结合 免疫荧光技术免疫荧光技术 抗原抗原 (细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分)用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布状态用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布状态 MPM-2 DAPI Merged Inter Pro Meta Ante Telo(六六)激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 (Laser Confocal(Laser Confocal Microscope,LCM)Microscope,LCM)光源：光源：通过共聚焦可进行光学切片通过共聚焦可进行光学切片 对固相、液相物体均可进行观察对固相、液相物体均可进行观察 特点：特点：激光激光 Q550MWQ550MW型型LCMLCM 二二.主要电镜制作技术主要电镜制作技术 三三.扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜 一一.电镜基本知识电镜基本知识 二、电子显微镜二、电子显微镜 电镜问世的必然性电镜问世的必然性 光学显微镜光学显微镜 0.2m0.2m 电子显微镜电子显微镜 0.2 n m0.2 n m 透射电子显微镜透射电子显微镜 （transmission electron microscopetransmission electron microscope，TEMTEM）扫描电子显微镜扫描电子显微镜 （scanning electron microscopescanning electron microscope，SEMSEM）电子显微镜与光镜的主要区别电子显微镜与光镜的主要区别 电电 镜镜 光光 镜镜 电子束电子束 可见光可见光 电磁透镜电磁透镜 玻璃透镜玻璃透镜 电磁聚焦电磁聚焦 机械聚焦机械聚焦 超薄切片超薄切片 (0.05(0.05 m)m)石蜡切片石蜡切片 (110(110 m)m)光光 源源 透透 镜镜 聚焦方式聚焦方式 切片厚度切片厚度 图图 像像 彩色图像彩色图像 黑白图像黑白图像 0.610.61 D=D=N N Sin Sin /2 /2 ：波长波长 N：介质折射率：介质折射率 ：物镜镜口角物镜镜口角（标本在光轴的（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）一点对物镜镜口的张角）通常通常 最大值最大值可达可达140140，空气中空气中N=1N=1，最短，最短的可见光波长的可见光波长=450nm=450nm，因此，普通光镜的因此，普通光镜的最大分辨率最大分辨率是是0.20.2 m m。肉眼的分辨率为肉眼的分辨率为0.2mm0.2mm，因此，光学显微镜的最大的因此，光学显微镜的最大的放大倍数放大倍数为为10001000。放大倍数放大倍数=显微镜的分辨率显微镜的分辨率 人肉眼的分辨率人肉眼的分辨率 分辨力分辨力(resolution)(resolution)是指是指显微镜能将近邻的显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：间的距离来表示，可通过公式换算出：一、电镜基本知识：一、电镜基本知识：名名 称称 波波 长长(nm)可见光可见光 760-390 紫外光紫外光 390-13 X 射线射线 13-0.05 射线射线 1-0.005 电子束电子束:100V 0.123 10,000V 0.0122 100,000V 0.00387 各种光及电子束的波长各种光及电子束的波长 RuskaRuska(1933193