黄芪汤基于miR-93和m...)辐射下丘脑损伤的防护机制_蒋国凤.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 805 黄芪汤基于miR-93和miR-140-5p介导的TLR4/MyD88/NF-B信号通路对12C6+辐射 下丘脑损伤的防护机制蒋国凤1，颜春鲁1,2，安方玉1,3，刘永琦1，石瑶1，吕栋辉1，袁灵青1，李孟翰1，王嘉玉1（1甘肃中医药大学，兰州 730101；2甘肃省中医药研究中心，兰州 730000；3甘肃省中医药防治慢性疾病重点实验室，兰州 730000）摘要：目的：观察黄芪汤对12C6+辐射脑损伤大鼠下丘脑组织中miRNA的基因表达及TLR4/MyD88/NF-B信号通路相关蛋白表达的影响，初步探讨黄芪汤对重离子辐射损伤的防护机制。方法：SPF级Wistar大鼠50只随机分为正常对照组，辐射模型组，黄芪汤高、中、低剂量组（18、9、4.5 gkg-1d-1），灌胃2周。干预7 d后除正常对照组外，其余各组脑组织给予4 Gy 12C6+离子束单次照射，辐射后7 d处死各组大鼠。HE染色观察垂体组织的病理形态学改变；ELISA检测下丘脑组织IL-1、IL-6的分泌情况；RT-PCR法检测下丘脑中miRNA与TLR4的基因表达；Western blot法检测下丘脑中TLR4、MyD88、NF-B p65、p-NF-B p65蛋白的表达。结果：与辐射模型组比较，黄芪汤高剂量组IL-1水平显著降低（P0.01），中、高剂量组IL-6水平及miR-93、TLR4的基因表达显著降低（P0.01），miR-140-5p的基因表达显著增加（P0.01），黄芪汤各剂量组中TLR4、MyD88、NF-B p65以及 p-NF-B p65蛋白表达显著降低（P0.01），黄芪汤高剂量组核固缩、深染现象明显减轻，偶见凋亡小体。Pearson分析表明，下丘脑中miR-93与TLR4蛋白、mRNA表达水平具有显著正线性相关性（P0.01），而miR-140-5p 与TLR4蛋白和mRNA表达水平呈现负线性相关性（P0.01）。结论：黄芪汤可能是通过抑制miR-93的过度表达和促进miR-140-5p的表达抑制TLR4/MyD88/NF-B信号通路的激活，从而抑制其下游的炎症级联反应，减轻重离子辐射后造成的下丘脑损伤，发挥抗辐射的作用。关键词：黄芪汤；重离子辐射；下丘脑损伤；miR-93；miR-140-5p；TLR4/MyD88/NF-B信号通路；12C6+；放疗 基金资助：国家自然科学基金项目（No.81760797），甘肃省“双一流”科研重点项目（No.GSSYLXM-05），甘肃省优秀研究生“创新之星”项目（No.2021CXZX-746），甘肃中医药大学科学研究与创新基金（No.2021 KCYB-4）Protective mechanism of Huangqi Decoction based on the TLR4/MyD88/NF-B signaling pathway mediated by miR-93 and miR-140-5p on hypothalamic injury caused by 12C6+radiationJIANG Guo-feng1,YAN Chun-lu1,2,AN Fang-yu1,3,LIU Yong-qi1,SHI Yao1,LYU Dong-hui1,YUAN Ling-qing1,LI Meng-han1,WANG Jia-yu1(1Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730101,China;2Gansu Provincial Research Center of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;3Gansu Provincial Key Laboratory of Chronic Diseases for Prevention and Treatment of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)Abstract:Objective:To observe the effects of Huangqi Decoction on the expression of miRNA genes in the hypothalamus and the expression of related proteins in the TLR4/MyD88/NF-B signaling pathway in 12C6+radiation brain injury 研究报告通信作者：颜春鲁，甘肃省兰州市和平工业开发区中医大道1号甘肃中医药大学中西医结合学院，邮编：730101，电话：0931-8765425E-mail：内文2.indd 8052023/2/28 10:36:00中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 806 目前，重离子（12C6+）辐射因具有反向深度剂量分布和较高的相对生物效应等优势逐渐成为治疗头颈部和中枢神经系统肿瘤的理想工具1。但是，重离子放疗技术在临床肿瘤治疗中产生良效的同时，也对受照射的肿瘤病灶周围正常组织造成了一系列的辐射损伤效应，主要表现为DNA损伤、细胞增殖或凋亡、基因表达改变、表观遗传学改变、炎症反应、致瘤性转化，甚至癌症形成等2-5。研究6-7还发现，任何剂量的重离子辐射均可导致中枢神经系统结构及功能损伤。下丘脑作为中枢神经系统的重要组成部分，重离子辐射脑损伤是否会引发下丘脑损伤及损伤的分子机制是什么，目前笔者尚未见相关报道。中医认为，辐射损伤的主要病机为“气阴两虚”，因此以“益气滋阴”为主要治法。出自 医学心悟的经典医方黄芪汤，由黄芪、熟地黄、麦冬、人参、枸杞子、五味子组成，具有益气养阴、生津养血之功效2。本课题组前期研究2,8-9也发现黄芪汤可以通过促进12C6+辐射脑损伤模型脑组织Bcl-2蛋白表达，抑制其脑组织Bax、caspase-3和核因子B（nuclear factor-B，NF-B）等蛋白表达来减轻脑组织神经细胞凋亡，还发现黄芪汤可以通过增强12C6+辐射脑损伤模型免疫力、抑制肾组织的细胞凋亡和调节外周造血系统对重离子辐射大鼠脑诱发的旁效应脏器损伤具有一定的保护作用。本研究拟探讨黄芪汤对12C6+辐射脑损伤大鼠下丘脑组织损伤的分子干预机制，为其临床应用提供实验 依据。材料1.动物 SPF级Wistar大鼠50只，雌雄各半，67周龄，体质量（18020）g，由甘肃中医药大学研究中心提供，实验动物许可证号：SCXK（甘）2015-0002。实验大鼠在标准实验室内饲养，饲养条件：室温25，湿度50%，定时换气，保持12 h/12 h光暗照明。所有动物自由饮水、摄食1周。本实验经甘肃中医药大学实验动物研究中心伦理委员会批准。2.药物 黄芪汤组成：黄芪30 g，熟地黄15 g，麦冬15 g，人参15 g，枸杞子15 g，五味子10 g，从甘肃省中医药大学附属医院购买，中药原药材由甘肃中医药大学所属的甘肃省高校中藏药化学与质量研究室提供并进行质量鉴定。4剂共400 g，加 2 400 mL双蒸水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮1 h，通过医用纱布过滤药液，而后再加2 400 mL双蒸水于药渣中，浸泡 30 min后，再次按照第一遍煎煮方法，将前后两次所得药液混合，然后用水提醇沉法，结合水浴加热法浓缩至400 mL，使药物质量浓度按原药材量计算为1 g/mL，使用时用超纯水倍比稀释。将上述浓缩好的药物用高压灭菌后，-4 冰箱保存备用。3.试剂 大鼠白介素（interleukin，IL）-1和IL-6 ELISA试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号分别为：MM-0046R1、MM-0190R1）；Trizol试剂（上海玉博生物科技有限公司，批号：267310）；反转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号分别为：11141-C、11202ES08）；miRNAmodel rats,and to preliminarily explore the protective mechanism of Huangqi Decoction on heavy ion radiation damage.Methods:Fifty SPF Wistar rats were randomly divided into normal control group,radiation model group,Huangqi Decoction high,medium and low dose groups(18,9,4.5 gkg-1d-1)were administered orally for 2 weeks.After 7 days of intervention,except for the normal control group,the brain tissues of the other groups were irradiated with 4 Gy 12C6+ion beam for a single time,and the rats in each group were sacrificed 7 days after the irradiation.HE staining to observe the pathological changes of pituitary tissue;ELISA to detect the secretion of IL-1 and IL-6 secretion in the hypothalamic tissue;RT-PCR method to detect the gene expression of miRNA and TLR4 in the hypothalamus;Western blot method to detect TLR4,MyD88,NF-B p65,p-NF-B p65 protein expression in the hypothalamus.Results:Compared with the radiation model group,the level of IL-1 in the high-dose group of Huangqi Decoction decreased(P0.01);the level of IL-6 and the gene expression of miR-93 and TLR4 decreased significantly(P0.01),while the gene expression of miR-140-5p in the medium and high dose groups was significantly increased(P0.01).The protein expression of TLR4,MyD88,NF-B p65 and p-NF-B p65 in Huangqi Decoction group was significantly reduced(P0.01).The high-dose Huangqi decoction group significantly reduced nuclear pyknosis and deep staining,and occasionally apoptotic bodies.Pearson analysis showed that the expression levels of miR-93 and TLR4 protein and mRNA in the hypotha