黄芪-莪术配伍调控EMT对...增殖、迁移和侵袭能力的影响_杨琦.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金面上项目（）；江苏省自然科学基金面上项目（）；江苏省社会发展面上项目（）；江苏省第六期 高层次人才培养工程项目；江苏省研究生培养创新工程研究生科研与实践创新计划项目（）通信作者吴晓宇，副教授，硕士生导师，主要从事结直肠癌等消化系统肿瘤研究，：（），：；唐德才，教授，博士生导师，主要从事中医药治疗肿瘤基础研究，：黄芪莪术配伍调控 对结肠癌 细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响杨琦，孙正，朱亦邈，向东阳，张群耀，王访，杨刚，杨灏，唐德才，吴晓宇（南京中医药大学 第一临床医学院，江苏 南京；南京中医药大学附属医院，江苏 南京；南京中医药大学 中医学院中西医结合学院，江苏 南京）摘要 观察并探讨黄芪莪术（）配伍调控上皮间质转化（）对结肠癌 细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。分别用、含药血清作用于人结肠癌 细胞株，采用噻唑蓝（）比色法测定细胞存活和生长，溴脱氧尿嘧啶（）细胞增殖实验和 实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡情况；将 雄性裸鼠建立结肠癌皮下移植瘤模型，分为空白对照组、组、组，造模后观察记录瘤体的体积与质量，对瘤组织进行 染色，蛋白免疫印迹（）检测黄芪莪术作用后 细胞和裸鼠瘤组织中、相关凋亡蛋白和、相关 蛋白的表达水平。结果显示，与空白对照组相比，作用后的细胞存活率显著降低，且处于增殖期细胞数量明显降低；各给药组的迁移和侵袭细胞数明显下降，细胞凋亡数也明显上升；体内实验中，与空白对照组比，各给药组的瘤体积和瘤体质量均降低，瘤组织呈现出细胞体积缩小，细胞核有固缩现象，表明 配伍可能改善 过程；此外，各给药组的 细胞和肿瘤组织中，、蛋白的表达均不同程度上升，、蛋白的表达均不同程度下降。综上，配伍能够显著抑制体内外结肠癌 细胞的增殖、侵袭迁移和上皮间质转化，诱导结肠癌细胞凋亡。关键词 黄芪莪术；结肠癌；增殖；侵袭迁移；上皮间质转化（），（，；，；，）（），（），（），（）杨琦等：黄芪莪术配伍调控 对结肠癌 细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响 ，（）（），（），；（）：.结直肠癌是全球第三大高发的恶性肿瘤，在我国发病率和病死率也逐年上升，且发病年龄呈年轻化趋势。目前结直肠癌的治疗主要以手术和化疗为主，但手术后仍复发率高。中药作为天然药物经济易得，不良反应少，可有效改善肿瘤患者的生活质量，减少不良事件的发生。中医认为瘀血阻滞是肿瘤发生的基本病理因素，正气亏虚则是其发病的内在基础。益气活血是中医临床治疗肿瘤的主要治则治法，黄芪莪术配伍为代表性的益气活血抗癌药对。近年在黄芪莪术方剂配伍研究中，发现其能够抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞凋亡等，或联合放化疗能增强抗肿瘤效果。二者配伍能够抑制多种癌细胞增殖、诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤转移，可能与其提高 蛋白表达，降低 表达，抑制上皮间质转化有关。因此，本研究采用黄芪莪术水煎液，进行体内和体外实验，观察并探讨黄芪莪术（）对结肠癌 细胞增殖、侵袭迁移、上皮间质转化（）及其凋亡的影响。材料与方法.药材与试剂黄芪、莪术饮片（江苏省中医院），培养基、胎牛血清（公司，货号、），.胰蛋白酶、噻唑蓝（）试剂盒、.结晶紫溶液、裂解液、电泳缓冲液（.）、凝胶配制试剂盒、脱脂奶粉（上海碧云天生物技术有限公司，货号、），溴脱氧尿嘧啶（）细胞增殖检测试剂盒（公司，货号），细胞凋亡试剂盒（公司，货号），基质胶（公司，货号），、（公 司，货 号、），、（公司，货号、），聚山梨酯（公司，货号），蛋白定量试剂盒（公司，货号），蛋白预染（南京良纬生物科技有限公司，货号）。.仪器 培养箱（公司，型号），超净工作台（公司，型号），酶标仪（公司，型号），低温冷冻离心机（公司，型号），小室（公司，型号），荧光倒置生物显微镜（南京江南永新光学有限公司，型号），恒定恒流电泳仪（公司，型号 ），流式细胞分析仪（公司，型号）。.细胞与动物人结肠癌 细胞株（中国科学院上海细胞生物研究所提供）。健康 级 裸鼠 只，小鼠 只，雄性，周龄，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物许可证号（苏）。饲养于南京中医药大学实验动物中心，室温 ，相对湿度 年 月第 卷第 期.，.，循环照明，自由饮水、摄食，级独立通风屏障系统。所有动物实验操作均符合南京中医药大学实验动物中心伦理委员会标准，实验动物伦理号。.药物制备 黄芪采用豆科植物蒙古黄芪的干燥根，莪术采用温郁金的干燥根茎。黄芪莪术饮片购自江苏省中医院中药房。黄芪莪术配伍药液制备：查阅文献黄芪莪术最佳配伍比例为 。精密称取黄芪 ，莪术 ，装入圆底烧瓶中，加水浸泡 ，加入 倍量纯水，加热煮沸后保持微沸，煎煮 ，过滤后得到提取液，过滤后加入 倍量纯水，煎煮 ，得到提取液，合并提取液，浓缩至 。分装，低温保存至 。.含药血清的制备取 只雄性 小鼠，随机分为 组，即空白对照组和给药组，按照动物实验给药剂量，给药组每天给予 ，灌胃，次，空白对照组给予等体积生理盐水，连续给药 。末次给药第 天腹主动脉采血，静置 ，离心 ；取上清，水浴中灭活 ，经.微孔膜过滤除菌，冷冻备用。.细胞培养及给药 复苏 细胞，置于含有胎牛血清及青链霉素双抗的 培养液中，于 、培养箱中培养。次日换液，第 天细胞进入对数生长期，传代。分组给药，空白对照组给空白对照组小鼠血清，黄芪莪术低浓度组给 含药血清，黄芪莪术中浓度组给 含药血清，黄芪莪术高浓度组给 含药血清。.检测细胞增殖 取处于生长对数期的 细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为 个，接种至 孔板，每孔（个），四周孔加入，放入培养箱中培养，次日贴壁，弃去原上清，按.项中分组给药，设 个复孔，继续培养；然后分别加入 溶液，孵育 ，吸除上清，每孔加二甲基亚砜（），摇床 ；在酶联免疫检测仪 处测量各孔的吸光度（），按公式计算药物对细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率（加样组 对照组）。.侵袭迁移实验 迁移实验：取对数生长期 细胞于 孔板中，按.项中分组给药，分别收集 组细胞，无血清培养液调整细胞密度，每孔 个，取 加入 上室，下室中加入 含 的培养液，放入培养箱中培养。后取出，纯水清洗 遍，然后加入 中性多聚甲醛固定 ，弃去多聚甲醛，加入.结晶紫 ，纯水清洗 遍，用棉签清除上室细胞；于倒置显微镜，在 倍光镜下随机选择 个不同视野拍照，利用 定量计算穿膜细胞数，取平均值，并统计分析。迁移抑制率（药物组迁移细胞数 空白组迁移细胞数）。侵袭实验：取基质胶于 冰箱过夜融化，次日，基质胶与培养液 稀释，每个 小室内加 ，孵育过夜成基底膜。其他步骤同迁移实验。.实验 将细胞爬片铺在 孔板中，取对数生长期 细胞于 孔板中（每孔 个，），按.项中分组给药培养，分别收集 组细胞，加入稀释后的 试剂（无血清培养基），每孔 ，孵育 ；按照 细胞增殖检测试剂盒说明继续操作，荧光显微镜拍照，标记的增殖细胞为绿色荧光，标记的所有活细胞为蓝色荧光。随机选取 个以上视野计算细胞增殖率。细胞增殖率增殖细胞数 细胞总数。.流式细胞凋亡实验 取对数生长期 细胞于 孔板中（每孔 个），按.项中分组给药培养，分别收集 组细胞，加入 预冷的 重悬细胞，离心弃上清；缓冲液中加入 ，混匀重悬细胞，避光孵育 ，加入 轻轻混匀，避光孵育；于 内用流式细胞仪检测，用 软件分析不同组的细胞凋亡率。.蛋白免疫印迹（）法 分别收集 组的 细胞，加入 吹打，离心去上清，加入适当裂解液充分裂解，法定量蛋白，配制蛋白，进行蛋白变性。然后进行 凝胶电泳，；采用湿转转膜，恒流转膜 ；将转好的膜放入用 清洗，脱脂奶粉，室温下摇床封闭 。按照抗体说明书，进行一抗稀释，配制好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配制好的一抗（封闭液 稀释），孵育摇床过夜；摇床，洗膜 次，每次 ；加二抗（），室温下孵育；加 洗膜 次，摇杨琦等：黄芪莪术配伍调控 对结肠癌 细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响床快速洗脱，每次 。将膜浸于显影液中（显影液 显影液 ），曝光显影，以 作为内参。.裸鼠 皮下移植瘤模型的建立及观察采用雄性 裸鼠，取对数生长期的 细胞制备成单细胞悬液，细胞密度为.个，抽取.，即接种细胞数为 个，接种于裸鼠右腋下。后长出直径约 的实体瘤。将模型裸鼠随机分为 组，每组 只，根据细胞实验结果分为空白对照组、黄芪莪术低剂量组（）、黄芪莪术高剂量组（），每天灌胃 次。给药 ，每 记录各组荷瘤裸鼠移植瘤的长径（）和短径（），以 .计算移植瘤体积，并绘制瘤体生长曲线。末次给药第 天处死全部裸鼠，摘取裸鼠实体瘤组织，并称重记录。对肿瘤组织进行 与 染色。.染色 取部分新鲜实体瘤组织固定于多聚甲醛中过夜，采用石蜡包埋并切成 的切片备用。石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯 ，二甲苯 ，无水乙醇，无水乙醇 ，乙醇 ，自来水洗。苏木素染色：切片入苏木素染液染 ，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。伊红染色：切片依次入、的梯度乙醇脱水各，入伊红染液中染色 。脱水封片：切片依次放入无水乙醇 ，无水乙醇 ，无水乙醇 ，二甲苯 ，二甲苯 透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。结果判读：细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。.数据处理实验数据用?表示，采用 软 件 的 和 进行统计学分析，.代表差异有统计学意义。结果.抑制体外结肠癌细胞增殖本研究采用 法和 实验 种方法来检测质量浓度梯度递增的、含药血清对结肠癌细胞增殖的影响，此外，为验证 的细胞毒性影响，采用 细胞（正常人肠上皮细胞）进行验证。实验结果中，随着 药物浓度的升高，与空白对照组相比，组的细胞存活率显著降低，明显能够抑制 结肠癌细胞和 结肠癌细胞的活性；对正常人肠上皮细胞的活性无明显影响。进一步采用 细胞增殖实验观察 对 结 肠 癌 细 胞 增 殖 的 影 响，蓝 色 荧 光 是 标记的所有活细胞，而绿色荧光为 标记，即有增殖能力的细胞，结果显示，与空白对照组相比，经不同浓度 处理后，结肠癌细胞的 荧光减弱，处于增殖期的细胞数量明显降低，见图；综上，能够显著抑制结肠癌细胞的体外增殖。.抑制体外结肠癌迁移与侵袭 、含药血清作用于 结肠癌细胞，实验检测不同浓度的 对 细胞侵袭迁移的影响，结晶紫染色结果显示，与对照组相比，能够显著抑制 结肠癌细胞侵袭和迁移，并且呈浓度依赖，见图。.诱导体外结肠癌细胞凋亡 流式细胞术检测 对 结肠癌细胞凋亡的影响，结果显示，与空白对照组相比，浓度升高，细胞凋亡率上升，并呈浓度依赖性。此外，细胞周期检测结果显示，与空白对照组相比，各给药组中 期细胞显著增加，期细胞显著减少；黄芪莪术低剂量组 期细胞差异无统计学意义，黄芪莪术中剂量和黄芪莪术高剂量组 期细胞显著增加，见图。进一步运用 分析检测 对 细胞凋亡相关蛋白表达的影响，结果显示，明显抑制 蛋白的表达，促进、蛋白的表达，见图。上述实验数据证实 在体外能够诱导 结肠癌细胞凋亡。.改善体外结肠癌细胞的上皮间质转化为了验证 对结肠癌 的影响，该研究通过 实 验 检 测 结 肠 癌 细 胞 中、相关 标志蛋白的表达水平。结果发现，能够显著下调 细胞、蛋白表达水平，显著上调 蛋白表达水平，见图。实验证明 能够在体外抑制结肠癌细胞上皮间质转化，且呈浓度依赖性。.抑制裸鼠 细胞皮下瘤的生长裸鼠荷瘤实验结果显示，给药组皮下瘤的体积与肿瘤质量均减轻，与空白对照组相比差异有统计学意义，见图。采用 实验检测裸鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白，结果与体外实验一致，见图。实 年 月第 卷第 期.，.，黄芪莪术；与空白对照组（）相比.，.（图 同）。实验样本量为；实验样本量为。图 黄芪莪术对 结肠癌细胞增殖的影响（?）.（?）图 黄芪莪术对 结肠癌细胞迁移（）与侵袭（）的影响（?，）.（）（）（?，）验结果表明，可抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡。.改善体内结肠癌细胞的上皮间质转化为验证 抑制肿瘤生长是否与改善 相关，采用 实验检测裸鼠肿瘤组 相关蛋白的情况，结果与体外实验一致，见图。同时对裸鼠肿瘤组织切片进行 染色，空白对照组的苏木素染色较深，细胞生长密集，形态完整，无层次，细胞核体积大小不一，间质存在