葛根芩连汤基于Wnt_β-...型大鼠肠道菌群作用机制研究_王楠.pdf

49第 2 5 卷 第 2 期 2023 年 2 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.2 Feb.，2023葛根芩连汤基于Wnt/-catenin信号通路对结肠癌模型大鼠肠道菌群作用机制研究王楠，方兴刚，廖莎，陈璐，黄超，曹森林，范利锋（湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000）基金项目：湖北省卫生健康委青年人才项目（WJ2021F032）作者简介：王楠（1987-），女，湖北丹江口人，主治医师，硕士，研究方向：中西医配合康复治疗各种肿瘤术后康复。通讯作者：范利锋（1977-），男，湖北麻城人，副主任医师，硕士，研究方向：中西医结合方法诊治各种老年病、慢性病、肿瘤性疾病。E-mail：。摘要：目的 基于Wnt/-catenin信号通路研究葛根芩连汤对结肠癌模型大鼠肠道菌群的作用机制。方法 选取SD健康雄性大鼠，随机分为正常组、结肠癌组、吉西他滨组及葛根芩连汤（GQD）低、中、高剂量组，对各组大鼠进行腹泻、便血、大便性状等肠炎症状评分，采用鲎试剂显色基质法测定血清内毒素脂多糖（LPS）水平，采用酶联免疫吸附实验法检测肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-6（IL-6）炎性因子水平，通过肠道内容物中微生物的培养检测大肠埃希菌、肠球菌、乳酸杆菌及双歧杆菌数量，采用 Shannons 法检测肠道内容物菌群的多样性，采用Western blot法检测Wnt/-catenin通路蛋白相对表达量。结果 与正常组相比，结肠癌组、吉西他滨组及GQD低、中、高剂量组大鼠TNF-、IL-10、IL-6、LPS水平及腹泻、便血、大便性状症状评分升高，差异具有统计学意义（P0.05）；与结肠癌组相比，GQD低、中、高剂量组大鼠TNF-、IL-10、IL-6、LPS水平及腹泻、便血、大便性状症状评分依次降低，差异具有统计学意义（P0.05）。与正常组相比，结肠癌组、吉西他滨组及GQD低、中、高剂量组大鼠大肠埃希菌、肠球菌数量，肠道菌群多样性分析中S值、E值、H值以及Wnt/-catenin通路蛋白水平升高，乳酸杆菌及双歧杆菌数量降低，差异具有统计学意义（P0.05）；与结肠癌组相比，GQD低、中、高剂量组大鼠肠道内容物菌群的S值、E值、H值均降低，差异具有统计学意义（P0.05）。结论 葛根芩连汤能有效改善腹泻、便血、大便性状等症状，减轻LPS及炎症反应，降低大肠埃希菌、肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量及肠道菌群数值，并升高Wnt/-catenin通路蛋白水平，Wnt/-catenin通路蛋白可有效减轻肠道反应，起到肠道保护作用。关键词：葛根芩连汤；结肠癌；炎症反应；肠道菌群中图分类号：R735.35 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)02-0049-05Mechanism of Gegen Qinlian Decoction（葛根芩连汤）on Intestinal Flora of Colon Cancer Model Rats Based on Wnt/-catenin Signaling PathwayWANG Nan，FANG Xinggang，LIAO Sha，CHEN Lu，HUANG Chao，CAO Shenlin，FAN Lifeng（Taihe Hospital，Affiliated Hospital of Hubei University Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China）Abstract：Objective To server the mechanism of Gegen Qinlian Decoction（葛根芩连汤，GQD）on intestinal flora in colon cancer model rats based on Wnt/-catenin signaling pathway.Methods Selected from SD healthy male rats，randomized into normal group，colon cancer group，gemcitabine group and low，medium and high dose of GQD groups，all groups of rats were scored for diarrhea，stool stool，stool traits and other enteritis symptoms，the serum levels of endotoxin lipopolysaccharide（LPS）were determined by Lmatrix，the levels of tumor necrosis factor-（TNF-），interleukin-10（IL-10），and interleukin-6（IL-6）were measured by enzyme-linked immunosorbent assay，the numbers of Escherichia.coli，Enterococcus，Lactobacillus and Bifidobacterium were detected by the culture of the microorganisms in the intestinal contents，the diversity of the intestinal contents was detected by Shannons，relative expression of Wnt/-catenin pathway proteins was determined by Western blot assay.Results Compared with the normal group，the levels of TNF-，IL-10，IL-6，LPS，and the scores of diarrhea，blood dose the stool，and stool traits were increased dose the colon cancer group，gemcitabine group，and GQD low-，medium-，and high dose groups.The difference was statistically significant（P0.05）；compared with the colon cancer group，the levels of TNF-，IL-10，IL-6，LPS and the symptom scores of diarrhea，blood in the stool and stool of the rats in the GQD low，medium and high dose groups decreased sequentially，and the difference was statistically significant（P0.05）.Compared with the normal group，the numbers of Escherichia coli and Enterococcus in colon cancer group，gemcitabine group and GQD low，medium and high dose groups，S value，E value，H value in the analysis of intestinal flora diversity and Wnt/-catenin pathway protein level increased，and the number of lactobacillus and Bifidobacteriun decreased，the difference was statistically significant（P0.05）.The S value，E value and H value of intestinal flora were all decreased，and the difference was statistically significant（P0.05）.Conclusion Gegen Qinlian Decoction can effectively improve symptoms such as diarrhea，blood in the stool，and stool characteristics，reduce DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.02.01150 辽宁中医药大学学报 25 卷LPS and inflammatory responses，reduce the number of Escherichia coli，Enterococcus，Lactobacillus，Bifidobacterium，and intestinal flora，and increase Wnt/-catenin pathway protein，Wnt/-catenin pathway protein can effectively reduce intestinal reactions and play a role in intestinal protection.Keywords：Gegen Qinlian Decoction（葛根芩连汤）；colon cancer；inflammatory reaction；intestinal flora结肠癌是常见恶性肿瘤疾病之一1。近年来，我国结肠癌的发病率随着年龄增长呈上升趋势，大多数诊断为结肠癌的患者年龄大于50岁，其中发病率城市高于农村，男性较高于女性2。结肠癌的症状及疾病进展程度与发病部位密切相关，早期一般无明显症状，随着疾病严重程度出现便血、腹痛等症状，由于消化能力和吸收能力下降，导致机体营养不良，体质量减轻，身形偏瘦。有研究表示肠道菌群失衡是结肠癌发生的重要原因之一3。结肠癌的治疗方法主要以手术为主、化疗为辅4。在中医领域中，中药治疗结肠癌效果显著，不良反应相比西医较小5。有研究显示，中药方剂治疗能够增强机体免疫功能，对身体健康具有多种益处，更适合结肠癌患者长期治疗6。本研究设计实验，建立结肠癌模型，使用葛根芩连汤治疗，探讨葛根芩连汤治疗效果及相关作用机制影响。1材料与方法1.1 材料选取60只SD健康雄性大鼠郑州大学（公共卫生学院），使用许可证号：SYXK（豫）2018-0005，鼠 龄710周，平 均 鼠 龄（8.51.2）周；体 质 量215.0240.0 g，平均体质量227.5 g。在温度（22.12.6），湿度50%55%的环境中喂养1周，光照12 h/d。主要试剂：兔抗大鼠重组人肿瘤坏死因子（TNF-）抗体研域（上海）化学试剂有限公司，规格：96T/48T；大鼠抗小鼠白细胞介素-10（IL-10）抗体（上海联迈生物工程有限公司，规格：96T/48T）；兔抗小鼠白细胞介素-6（IL-6）抗体妙顺（上海）生物科技有限公司，规格：96T/48T；大鼠抗小鼠脂多糖（LPS）抗体（上海科敏生物科技有限公司，货号：MAB13653）。1.2 建模及分组干预取10只大鼠设为正常组，其余50只参照文献7建立大鼠结肠癌模型。建模过程中死亡5只，将剩余45只结肠癌大鼠随机分为结肠癌组、吉西他滨组（阳性对照，90 mgkg-1d-1）及葛根芩连汤高中低剂量组（16、8、4 gkg-1d-1）各9只。第1周除正常组外，其他各组大鼠给予DMH 40 mgkg-1d-1颈部皮下注射，隔天1次，共3次；第2、3、4周分别对各组大鼠使用2%葡聚糖