高铜通过转录水平上调LC3...癌HepG2细胞自噬的研究_张萌.pdf

实验研究/论著高铜通过转录水平上调L C 3表达诱导肝癌H epG 2细胞自噬的研究张萌,石萌,南欣睿,张杰,杜文倩,李超,刘宝琴中国医科大学生命科学学院,辽宁 沈阳1 1 0 1 2 2摘要:目的 探究微量元素铜对肝癌H e p G 2细胞自噬水平的影响,解析铜离子诱导肝癌自噬的分子机制。方法 0、1 0、5 0、1 0 0和2 0 0m o l/L硫酸铜(C u S O4)处理H e p G 2细胞2 4h,1 0 0m o l/LC u S O4处理H e p G 2细胞0、4、8、1 2、2 4h后检测自噬相关蛋白表达,蛋白质印迹法检测H e p G 2细胞内自噬分子标志物L C 3-/L C 3-和p 6 2,以及线粒体自噬标志分子P a r k i n表达;实时荧光定量P C R(q R T-P C R)检测L C 3和p 6 2mR NA表达,细胞计数试剂盒检测细胞活力。R F P-G F P荧光双标L C 3慢病毒系统感染H e p G 2细胞,C u S O4处理表达R F P-G F P-L C 3 B的H e p G 2细胞,共聚焦检测自噬流变化。结果 1 0、5 0、1 0 0、2 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞后,L C 3-/L C 3-比值呈剂量(F=65 1 9.0 0 0,P0.0 0 1)和时间依赖性升高(F=9 3 4.3 0 0,P0.0 0 1);p 6 2蛋白表达呈剂量(F=5 55 6 4.0 0 0,P0.0 0 1)和时间依赖性降低(F=1 14 1 3.0 0 0,P0.0 0 1)。共聚焦结果显示铜离子蓄积诱导H e p G 2细胞内自噬小体数目(t=3 0.0 4 0,P0.0 0 1)及自噬溶酶体数目(t=2 7 2.0 0 0,P0.0 0 1)均增加。1 0 0m o l/LC u S O4引起H e p G 2细胞中L C 3-/L C 3-比值增加(t=1 0 3.6 0 0,P0.0 0 1);p 6 2蛋白表达下降(t=1 4 6.6 0 0,P0.0 0 1),E B S S也引起p 6 2蛋白表达下降(t=1 4 6.0 0 0,P0.0 0 1);而对P a r k i n蛋白表达没有影响。1 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞2 4h后L C 3 mR NA表达上调,而E B S S饥饿处理则不影响L C 3 m R NA表达,F=3 0 2.4 0 0,P0.0 0 1;p 6 2mR NA表达均一定程度上调,F=6 1.7 5 0,P0.0 0 1。细胞计数实验结果表明1 0 0m o l/LC u S O4和E B S S饥饿均使细胞活力降低,F=1 1 1.7 0 0,P0.0 0 1。结论 高铜能够通过转录水平上调L C 3分子mR NA表达诱导肝癌H e p G 2细胞内自噬增强。关键词:肝癌;铜稳态;L C 3;自噬;p 6 2中图分类号:R 7 3 5.7 文献标识码:A 文章编号:1 6 7 3-5 2 6 9(2 0 2 2)2 4-1 7 3 4-0 7H i g hc o p p e r i n d u c e sa u t o p h a g yo fH e p G 2c e l l sb yu p-r e g u l a t i n gL C 3e x p r e s s i o na t t r a n s c r i p t i o n a l l e v e lZ HAN G M e n g,S H IM e n g,NANX i n-r u i,Z HAN GJ i e,D U W e n-q i a n,L IC h a o,L I UB a o-q i nS c h o o l o fL i f eS c i e n c e s,C h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t y,S h e n y a n g1 1 0 1 2 2,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to f t r a c ee l e m e n tc o p p e ro na u t o p h a g yo fH e p G 2c e l l s,a n dt oe l u c i d a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f c o p p e r-i n d u c e da u t o p h a g yo fH e p G 2c e l l s.M e t h o d s C o p p e r s u l f a t e(C u S O4)a t c o n c e n t r a t i o no f0,1 0,5 0,1 0 0a n d2 0 0m o l/Lw a su s e dt ot r e a tH e p G 2c e l l s f o r2 4h;a f t e r t h eH e p G 2c e l l sw e r e t r e a t e dw i t h1 0 0m o l/LC u S O4f o r 0,4,8,1 2a n d2 4h o u r s,t h e e x p r e s s i o no f a u t o p h a g y-r e l a t e dp r o t e i n sw a sd e t e c t e d.T h e e x p r e s s i o no f a u t o p h-a g ym o l e c u l a rm a r k e r sL C 3-/L C 3-a n dp 6 2i nH e p G 2c e l l sa n dt h ee x p r e s s i o no fm i t o c h o n d r i a la u t o p h a g ym a r k e rP a r k i nw e r ed e t e c t e db yw e s t e r nb l o t.T h ee x p r e s s i o no fL C 3 a n dp 6 2mR NA w a sd e t e c t e db yr e a l-t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v eP C R(q R T-P C R),a n dt h ec e l l v i a b i l i t yw a sd e t e c t e db yc e l l c o u n t i n gk i t.H e p G 2c e l l sw e r e i n f e c t e db yR F P-G F Pf l u o r e s c e n td o u b l e l a b e l e dL C 3 l e n t i v i r u s s y s t e m.H e p G 2c e l l s e x p r e s s i n gR F P-G F P-L C 3 Bw e r e t r e a t e dw i t hC u S O4,a n da u t o p h a g i c f l o wc h a n g e sw e r ed e t e c t e db yc o n f o c a ld e t e c t i o n.R e s u l t s A f t e rt h eH e p G 2c e l l sw e r et r e a t e dw i t h1 0,5 0,1 0 0a n d2 0 0m o l/LC u S O4,t h eL C 3-/L C 3-r a t i oi n c r e a s e di nad o s e-d e p e n d e n tm a n n e r(F=6 5 1 9.0 0 0,P0.0 0 1)a n dt i m e-d e p e n d e n tm a n n e r(F=9 3 4.3 0 0,P0.0 0 1).T h ee x p r e s s i o no fp 6 2p r o t e i nd e c r e a s e d i nad o s e-d e p e n d-e n tm a n n e r(F=5 55 6 4.0 0 0,P0.0 0 1)a n dt i m e-d e p e n d e n tm a n n e r(F=1 14 1 3.0 0 0,P0.0 0 1).T h ec o n f o c a l r e s u l t ss h o w e dt h a t t h en u m b e ro f a u t o p h a g o s o m e s(t=3 0.0 4 0,P0.0 0 1)a n da u t o p h a g i c l y s o s o m e s(t=2 7 2.0 0 0,P0.0 0 1)i nH e p G 2c e l l si n d u c e db yc o p p e ri o na c c u m u l a t i o ni n c r e a s e d.C u S O4a tac o n c e n t r a t i o no f1 0 0m o l/Li n c r e a s e dt h eD O I:1 0.1 6 0 7 3/j.c n k i.c j c p t.2 0 2 2.2 4.0 3基金项目:国家自然科学基金(8 1 8 7 2 2 5 7);辽宁省自然科学基金(2 0 2 2-M S-1 9 9);省博士科研启动基金计划(2 0 2 0-B S-1 0 1)第一作者:张萌,女,天津人,硕士,主要从事铜离子稳态与肿瘤、基因表达调控等研究工作。E-m a i l:z m 0 9 0 91 2 6.c o m通信作者:刘宝琴,女,甘肃靖远人,博士,教授,主要从事铜离子稳态与肿瘤,基因表达调控等研究工作。E-m a i l:b q l i u c m u.e d u.c n4371张萌,等 高铜通过转录水平上调L C 3表达诱导肝癌H e p G 2细胞自噬的研究L C 3-/L C 3-r a t i o i nH e p G 2c e l l s(t=1 0 3.6 0 0,P0.0 0 1).T h e e x p r e s s i o no f p 6 2p r o t e i nd e c r e a s e d(t=1 4 6.6 0 0,P0.0 0 1),a n dE B S Sa l s oc a u s e dt h ed e c r e a s eo fp 6 2p r o t e i ne x p r e s s i o n(t=1 4 6.0 0 0,P0.0 0 1).I th a dn oe f f e c to nP a r k i np r o t e i ne x p r e s s i o n.A f t e r2 4h o u r so fe x p o s u r et o1 0 0m o l/LC u S O4,t h ee x p r e s s i o no fL C 3 mR NAi nH e p G 2c e l l sw a su p-r e g u l a t e d,w h i l eE B S Ss t a r v a t i o nd i dn o t a f f e c t t h e e x p r e s s i o no fL C 3 m R NA(F=3 0 2.4 0 0