葛根异黄酮抗缺血性脑卒中的活性筛选与研究_陆瑶.pdf

葛葛根根异异黄黄酮酮抗抗缺缺血血性性脑脑卒卒中中的的活活性性筛筛选选与与研研究究陆瑶，周密，鲁婷婷，郑梅竹（长春师范大学生命科学学院，吉林 长春；长春师范大学中心实验室，吉林 长春）摘 要利用 细胞建立糖氧剥夺（）体外脑卒中损伤模型，采用该模型对葛根异黄酮抗缺血性脑卒中活性进行筛选和验证。评价指标包括：细胞存活率检测、细胞内活性氧（）含量检测、乳酸脱氢酶（）释放率检测、细胞内钙离子（）浓度检测和细胞凋亡程度检测，并利用蛋白免疫印迹法（）检测凋亡蛋白 淋巴细胞瘤 基因（，）和 淋巴细胞瘤 基因相关启动子（，）的表达水平。结果显示，与模型组比较，葛根异黄酮保护组能够抑制细胞凋亡，降低细胞内 水平，降低 释放、抑制细胞内 累积，并且 表达水平升高，表达水平降低，与 蛋白表达量比值上调。表明葛根异黄酮能减轻氧糖剥夺 复氧（）造成的 细胞损伤，提升细胞存活率，葛根异黄酮可能具有一定的抗缺血性脑卒中活性。其作用机制可能与抑制神经细胞的凋亡，减少神经元丢失相关。关键词葛根异黄酮；脑卒中；细胞中图分类号 文献标志码 文章编号（）缺血性脑卒中（）作为一种脑血管疾病，是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。对于缺血性脑卒中，临床上主要采用的治疗方法是溶栓治疗。但有可能引起脑出血或再灌注损伤，因而有很大的缺陷。药物治疗主要包括合成类药物和天然药物。合成药物是目前临床上比较常见的脑保护药物。相对来说，天然药物的药效更温和，对病人的不良反应也更少，适合长期使用。异黄酮是一种存在于植物中的芳香含氧杂环化合物，具有抗肿瘤、抗老年痴呆、抗炎症等生理功能。近年来，异黄酮类化合物的抗脑卒中作用陆续有了研究报道。研究发现，葛根异黄酮在一定程度上有修复血管内皮损伤的作用，对脑卒中病人的康复有重要意义。本实验利用 细胞建立 缺血性脑卒中细胞模型对葛根异黄酮的抗脑卒中活性进行初步筛选及活性验证。材料与方法 细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化细胞株细胞（细胞），来源于中国科学院上海细胞库。收稿日期基金项目国家自然科学基金资助项目“药用植物中异黄酮类成分抗缺血性脑卒中的活性筛选及作用机制研究”（）；吉林省 科 技 厅 基 金 资 助 项 目“葛 花 中 异 黄 酮 类 成 分 抗 缺 血 性 脑 卒 中 的 活 性 筛 选 及 作 用 机 制 研 究”（）；吉林省教育厅基金资助项目“葛花中鸢尾苷抗缺血性脑卒中的活性评价及作用机制研究”（）；长春师范大学研究生科研创新项目“基于网络药理学和分子对接研究射干中野鹫尾苷抗缺血性脑率中的活性评价及作用机制”（第 号）。作者简介陆瑶，女，硕士研究生，从事神经退行性疾病研究。通信作者郑梅竹，女，教授，从事天然产物研究。药物与试剂（美国 公司），依达拉奉（公司），葛根异黄酮（上海源叶生物科技有限公司），乳酸脱氢酶（）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），钙离子荧光探针试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），二苯基四氮唑溴盐（）（北京索莱宝科技有限公司）。仪器二氧化碳培养箱（德国 公司），全自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司），多功能读板器（美国 公司）。方法 细胞培养细胞复苏：取冻存的细胞管于 水浴，这一步骤需要快速平稳，随后轻轻摇晃，转移细胞悬液并补加完全培养液（含 胎牛血清和 青霉素链霉素双抗溶液的高糖 培养基），混匀后于，培养箱中培养。按时观察细胞贴壁情况，及时更换培养液，去除无血清冻存液对细胞的影响。根据细胞状态，每 天更换一次培养液。实验分组及处理取生长状态良好的细胞，制成 个 细胞悬液接种于 孔板中，每孔 ，培养 。再将细胞随机分为 组。对照组（简称）：在完全培养液中培养 ，不加 处理。模型组（简称）：去除培养液，用不含葡萄糖的 稀释 溶液（）损伤细胞 ，然后去除 溶液，换为完全培养液孵育 ，构建糖氧剥夺 复氧（）离体脑卒中模型。药物组：葛根异黄酮（、）给药组（简称、），阳性药依达拉奉（）给药组（简称）。处理后，将细胞分别转移至含葛根异黄酮（、）和依达拉奉（）的完全培养液中，孵育 ，确保细胞复氧复糖。细胞存活率的测定使用 法检测细胞存活率。按 步骤处理细胞后，加入 孔的 溶液，培养箱中孵育。去除培养基后，加入 孔，待 充分溶解紫色甲臜，用酶标仪测定 处吸光度，并计算细胞的相对存活率。细胞内 释放量的测定使用 细胞毒性检测试剂盒对细胞外乳酸脱氢酶的释放量进行测定。按 步骤处理细胞后，从 孔板中收集培养液，每孔收集 ，移入新的 孔板中，与 工作液混合，室温黑暗孵育。在 处测定吸光度，相对释放量以最大酶活性（细胞内和细胞外）的百分比表示。细胞内 检测依据 步骤处理细胞后，在 黑暗条件下，取用 溶液对 细胞进行 孵育，用无血清培养基清洗细胞。用多功能读板器检测荧光强度，细胞内 的相对生成量以对照的百分比表示，同时为排除细胞密度对其影响，后续做 使细胞密度归一化后，计算荧光强度。细胞内 含量检测用试剂盒中提供的荧光探针 检测细胞内 含量。按 步骤处理细胞后，用（）在 避光孵育 ，装载荧光探针，然后适当洗涤，去除细胞外染料，在激发波长和发射波长检测荧光，设置波长分别为 和 。后续做 使细胞密度归一化后，计算最终荧光强度。流式细胞术检测细胞凋亡率首先将细胞单层接种于 孔板中，按 步骤造模处理、给药处理后，取出各组细胞，分别收集各组细胞上清液。用胰蛋白酶消化细胞，离心 ，再用提前预冷的 清洗细胞 遍，结合液重悬细胞。每组细胞加入 和碘化丙啶染色液各 ，室温避光反应 ，随后置于冰浴中，内流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，过程避光。各组细胞中 和 蛋白表达水平的检测各组细胞中 和 蛋白表达水平的检测用细胞蛋白裂解抽提试剂盒提取细胞总蛋白，用蛋白质定量法测定蛋白的浓度。取 蛋白，经 的 分离后，转移至 膜上，用 脱脂奶粉于室温封闭 ；分别加入 和 抗体（稀释）及 单克隆抗体（稀释），于 培养过夜；洗涤 次，每次 ，加入 标记的羊抗兔（稀释），室温培养 ；洗涤 次，显影。数据处理数据采用 软件分析，所有数据由均值标准差表示。采用 检验确定显著性，有统计学意义。实验结果 葛根异黄酮对正常 细胞存活率的影响如表 所示，葛根异黄酮、与 细胞作用 后，细胞存活率与正常对照组比较差异不显著。说明在剂量范围内，对 细胞没有毒性或毒性很小，可以忽略不计，这为后续相关指标的检测提供安全性评价。表 葛根异黄酮对 细胞存活率的影响（，）葛根异黄酮浓度（）细胞存活率 葛根异黄酮对 诱导的 细胞存活率的影响如表 所示，对照组细胞存活率为，与对照组细胞比较，模型组细胞存活率下降至（），差异显著。与模型组细胞相比较，葛根异黄酮、三个剂量组和依达拉奉给药组的细胞存活率与模型组比较显著增加（，）。表 葛根异黄酮对 诱导的 细胞存活率的影响（，）组别 浓度（）细胞存活率 对照模型葛根异黄酮葛根异黄酮 葛根异黄酮 依达拉奉 注：表示与对照组比较差异显著，表示与对照组比较差异极显著，；表示与模型组比较差异显著，.，表示与模型组比较差异极显著，下同。葛根异黄酮对 诱导的 细胞 释放率的影响如表 所示，对照组细胞 释放率为，与对照组细胞比较，模型组 释放率急剧增加至.（），差异显著。与模型组细胞相比较，葛根异黄酮、两个剂量组和依达拉奉给药组 释放率显著降低（，）。表 葛根异黄酮对 诱导的 细胞 释放率的影响（，）组别剂量（）漏出率 对照模型葛根异黄酮葛根异黄酮葛根异黄酮 依达拉奉 葛根异黄酮对 诱导的 细胞内 浓度的影响如表 所示，模型组与对照组比较，钙离子浓度显著升高（）。葛根异黄酮、三个剂量组与模型组比较显著降低（，）。结果看出葛根异黄酮可以抑制细胞内钙离子累积，从而降低细胞凋亡。表 葛根异黄酮对 诱导的 细胞 浓度的影响（，）组别剂量（）漏出率 对照模型葛根异黄酮葛根异黄酮葛根异黄酮 依达拉奉 葛根异黄酮对 诱导的 细胞内 的影响如表 所示，对照组细胞平均荧光强度为，模型组的细胞平均荧光强度为（），与对照组比较，模型组平均荧光强度显著增加（）。当加入 ，同时加入葛根异黄酮作用 后，各组细胞平均荧光强度明显下降，葛根异黄酮，两个剂量组和依达拉奉给药组明显降低细胞内 水平（）。表 葛根异黄酮对 诱导的 细胞内 的影响（，）组别剂量（）细胞内 水平（）对照模型葛根异黄酮葛根异黄酮葛根异黄酮依达拉奉 流式细胞术检测各组细胞凋亡率如图 和图 显示，对照组的细胞凋亡率为，模型组的细胞凋亡率为，经过 后，模型组细胞凋亡比例明显高于对照组。葛根异黄酮 处理组细胞凋亡率为，处理组细胞凋亡率为，处理组细胞凋亡率为，依达拉奉药物处理组细胞凋亡率为.，葛根异黄酮、剂量组和依达拉奉组与模型组相比细胞凋亡率有显著降低（）。图 不同葛根异黄酮作用后的流式细胞凋亡图图 不同浓度葛根异黄酮对 细胞凋亡程度的影响 各组细胞中 和 蛋白的表达水平如图（）和（）所示，与对照组比较，模型组 与 蛋白表达量比值显著降低（）；与模型组比较，葛根异黄酮（）和依达拉奉给药组细胞 与 蛋白表达量比值明显升高（.）。表明葛根异黄酮 能够增加 损伤细胞后 与 蛋白表达量比值，从而发挥抗凋亡作用。（）各组细胞、和 蛋白的表达量（为内标蛋白）（）各组细胞 与 蛋白表达量的比值图 不同浓度葛根异黄酮对 诱导的 细胞中 蛋白表达量的影响 讨论葛根是一种具有药用价值的保健食品，在国内生产规模较大，受众人群广泛。葛根中的异黄酮类物质含量高，活性强。近年来发现，葛根异黄酮类物质具有抗炎、抗心肌缺血缺氧性损伤、保护脑神经等多种作用。由于许多天然药物具有较低的副作用，多环节，多靶点等优势，在临床上得到了广泛的应用，葛根的研究和开发也越来越受到业界的重视。在缺血性脑卒中发生后，中枢神经元会在短期内释放出大量的兴奋性神经递质。例如谷氨酸等，一定范围内的谷氨酸可以保持细胞的正常功能。而发生缺血性脑卒中时，谷氨酸含量升高，会扰乱其动态平衡，从而导致中枢神经系统中毒，进而导致神经元死亡。与此同时 泵的活性降低，使 在细胞中的浓度增加，并在细胞中积累，从而影响 的信号转导。由于 浓度的提高，也会产生游离的脂肪酸，生成大量的自由基，从而破坏了生物膜，加重了细胞的损伤，进而增加心肌梗死的发生率。是一种稳定的胞浆酶，它存在于细胞中。在一般条件下不能穿透细胞膜。而在细胞受损的情况下，细胞的渗透能力发生变化，被释放到细胞膜外。本实验使用经典缺血性脑卒中细胞模型发现经过葛根异黄酮的处理后，能够使细胞模型的损伤情况得到明显改善。葛根异黄酮在一定程度上可降低 损伤后的细胞 释放率；降低细胞内 水平，抑制细胞内 积累；抑制细胞内 累积，降低细胞凋亡。细胞凋亡是造成脑缺血后神经细胞死亡的重要因素。家族由抗凋亡成员和促凋亡成员组成，共同调控细胞凋亡。是通过抑制谷胱甘肽（）的释放，降低细胞中的氧化还原电位，从而抑制细胞凋亡的。是 家族的促凋亡成员，它仅包含 区，是 和 家族蛋白结合的关键部位。的促凋亡作用是与 结合，拮抗 的抑制线粒体自噬作用，从而调控细胞凋亡的。本研究发现葛根异黄酮可以通过上调，下调 的表达从而维持 和 蛋白表达的比率。综合研究结果，推测葛根异黄酮抗缺血性脑卒中活性可能与抑制细胞凋亡，减少神经元丢失相关。上述结果从不同方面验证了葛根异黄酮的抗缺血性脑卒中作用。但是体外模型研究是天然产物药用的前期基础，进行构效分析，还需要后续相关体内模型的进一步研究。参考文献 （），（）：，：，（）：，（）：崔小英，于建设，都义日，等脑缺血再灌注损伤及脑保护药物研究进展河北医药，（）：陈明惠，周密，王文丽，等大豆异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用长春师范大学学报，（）：，（）：，（）：，（）：程浩，陈冲，黄静，等葛根药理作用、微生物转化及发酵食品应用现代食品，（）：宋子欣种在土里的“黄金”葛根农村百事通，（）：胡心怡，吴田泽，侯聪，等多组学技术在葛根品质提升研究中的应用进展世界中医药，（）：，付旭冉，叶永丽，赵晓联，等葛根功效活性及其在食品中的应用进展食品研究与开发，（）：，（）：张宝荣，谭颖颖，张琪葛