高盐诱导高血压大鼠心肌间质...P-1和IL-6的表达研究_曾清清.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan；40（1）高盐诱导高血压大鼠心肌间质重构及SHIP-1和IL-6的表达研究*曾清清1，高忠兰2#，陈务贤2，黄荣杰2（1.广西医科大学，南宁530021；2.广西医科大学第一附属医院心血管内科，南宁530021）摘要目的：探讨高盐诱导高血压大鼠心肌间质纤维化及SH2结构域的肌醇5-磷酸酶1（SHIP-1）和白介素6（IL-6）的表达。方法：将25只SD雄性大鼠随机分为对照组和模型组，模型组给予高盐饲料（含3%NaCl）喂养12周，对照组给予普通饲料喂养12周。每两周测量大鼠尾动脉收缩压，12周后称取大鼠体重和心脏重量，计算心脏重量指数（心脏重量/体重）。采用苏木精伊红（HE）染色及Masson染色观察心肌组织病理学改变。分别采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫组化法检测SHIP-1和IL-6 mRNA及其蛋白表达。结果：模型组喂养12周后的收缩压和心脏重量指数均高于对照组（P0.05）。与对照组比较，模型组大鼠心肌组织大量炎性细胞浸润，胶原纤维显著增多，胶原容积分数（CVF）高于对照组（P0.05）。模型组心肌组织SHIP-1 mRNA及蛋白表达量低于对照组，IL-6 mRNA及蛋白表达量高于对照组（均P0.05）。结论：高盐诱导高血压大鼠出现心肌间质纤维化重构，同时SHIP-1表达下调，IL-6表达上调。关键词高盐诱导高血压；SHIP-1；IL-6；心肌间质纤维化中图分类号：R544.1文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0054-05DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.009Myocardial interstitial remodeling and expressions of SHIP-1 and IL-6 in high-salt-induced hypertensive ratsZeng Qingqing1,Gao Zhonglan2,Chen Wuxian2,Huang Rongjie2.(1.Guangxi Medical University,Nanning530021,China;2.Department of Cardiovascular Medicine,The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical Uni-versity,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To investigate myocardial interstitial fibrosis and the expressions of SH2 domain-contain-ing inositol 5-phosphatase 1(SHIP-1)and interleukin-6(IL-6)in high-salt-induced hypertensive rats.Methods:Twenty-five SD male rats were randomly divided into control group and model group.The model group and thecontrol group were fed respectively with high salt diet(containing 3%NaCl)and ordinary diet for 12 weeks.Therat tail artery pressure was measured once every two weeks.After 12 weeks,the rats body and heart weight wereweighed and the heart mass index(heart weight/body weight)was calculated.Hematoxylin-eosin(HE)stainingand Masson staining were used to observe the histopathological changes of myocardium.The mRNA and proteinexpressions of SHIP-1 and IL-6 were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)and immunohistochemistry,respectively.Results:Systolic blood pressure and heart mass index in themodel group were higher than those in the control group after 12 weeks of feeding(P0.05).Compared with thecontrol group,the myocardial tissue of rats in the model group was infiltrated by a large number of inflammatorycells,the collagen fiber significantly increased,and the collagen volume fraction(CVF)was higher than that inthe control group(P0.05).The mRNA and protein expression of SHI-1 in the model group was lower than thatin the control group while the mRNA and protein expression of IL-6 was higher than that in the control group(allP0.05).Conclusion:In high-salt-induced hypertensive rats,myocardial interstitial fibrosis remodeling is ob-served;SHI-1 expression is down-regulated while IL-6 expression is up-regulated.Keywordshigh-salt-induced hypertension;SHIP-1;IL-6;Myocardial interstitial fibrosis*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81860087）通信作者，黄荣杰：E-mail：；陈务贤，E-mail：#共同第一作者收稿日期：2022-09-27 54高盐摄入已被证明对心血管病理生理机制产生影响，除了影响血压，其对左心室质量、动脉硬度、肾功能、心输出量和交感神经兴奋性改变等均有不利影响，主要机制包括过度炎症和氧化应激1。心肌肥厚和心肌间质纤维化是左心室重构的共同特征2。在高血压患者中，伴左室肥厚者发生心力衰竭的风险是无左室肥厚者的2.8倍3，心肌纤维化是心血管死亡及心源性猝死发生的独立预测因素4。白细胞介素（IL）-6和C反应蛋白（CRP）水平显著升高与心肌间质纤维化加重有关5。含SH2结构域的肌醇-5-磷酸酶1（SHIP-1）是肌醇磷酸酶家族成员之一，研究表明，SHIP-1激动剂能够诱导促炎细胞因子（如IL-10、IL-6）的释放，产生抗炎作用6。但SHIP-1和IL-6在高盐诱导高血压大鼠左室间质重构中的作用目前尚无研究报道。本研究通过复制高盐高血压模型，观察高盐诱导高血压大鼠心肌间质重构及SHIP-1和IL-6的表达变化。1材料与方法1.1实验动物25只5周龄雄性SD大鼠，体重130150 g，购于广西医科大学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK桂2020-0004，动物生产许可证号：SCXK桂2020-0003。所有大鼠饲养于清洁通风环境，温度（242），湿度（555）%，12 h/12 h明暗交替。本研究动物实验过程遵守实验动物伦理学规定。1.2动物分组及造模将SD大鼠随机分为对照组（n=10）和模型组（n=15）。模型组给予高盐饲料（含3%NaCl）喂养 12 周7，对照组给予普通饲料喂养12周，均自由取食。在安静状态下，每两周使用无创鼠尾动脉血压测量仪测量大鼠尾动脉收缩压、平均动脉压、舒张压和心率，连续测量3次，取平均值。收缩压19.95 kPa视为高血压造模成功8。1.3主要试剂与仪器cDNA逆转录试剂盒、PCR检测试剂盒、总RNA提取试剂盒均购自南京诺唯赞公司；兔抗SHIP-1多克隆抗体、兔抗IL-6单克隆抗体均购自Abclonal公司；免疫组化二抗试剂盒购自上海生工公司；DAB 显色试剂盒、苏木精伊红（HE）染色试剂盒、Masson染色试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司；4%多聚甲醛购自biosharp公司。Softron智能大小鼠无创血压测量仪（BP-2010A）购自北京软隆生物技术有限公司；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。1.4心脏重量指数测定喂养12周后称重，用戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠，摘取心脏，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称量心脏重量，计算心脏重量指数，即心脏重量与大鼠体重的比值9。1.5心肌组织HE染色取左心室组织，用4%多聚甲醛固定，制作4 m厚石蜡切片，经HE染色后，显微镜下观察心肌细胞结构、大小、出血水肿、炎性细胞浸润，以及细胞核大小、有无增多或畸形等变化。1.6心肌组织 Masson 染色取心肌组织石蜡切片，经Masson染色后观察左心室间质胶原纤维变化，并通过 Image J 软件分析计算胶原容积分数（CVF）。每张切片随机选取5个视野，显微镜下观察、评估蓝色心肌胶原纤维面积，并计算其在选定对象面积的占比，即为CVF10。1.7RT-qPCR 法 检 测 心 肌 组 织 SHIP-1 和 IL-6mRNA表达取左心室组织，提取总RNA，反转录为cDNA，行PCR扩增。PCR反应条件：95 预变性30 s；95 变性10 s，60 退火、延伸30 s，共循环40次。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。引物序列如下：SHIP-1上游：5-TCT-ACGTGATTGGCACCCAG-3，下游：5-AGTGC-AGATGTGGCTGATCC-3；IL-6 上游：5-CACTT-CACAAGTCGGAGGCT-3，下游：5-TCTGACA-GTGCATCATCGCT-3；内参-actin上游：5-CGC-GAGTACAACCTTCTTGC-3，下游：5-CGTCATC-CATGGCGAACTGG-3。采用2-CT法计算目的基因相对表达量。1.8免疫组化法检测心肌组织SHIP-1和IL-6蛋白表达取心脏组织，根据试剂盒说明书步骤，采用免疫组化法对心肌组织中SHIP-1和IL-6蛋白表达进行检测。SHIP-1蛋白阳性表达为棕色颗粒，定位于细胞质或细胞核，IL-6蛋白阳性表达为棕黄色颗粒，定位于细胞质。显微镜下观察，每张切片随机选取5个高倍镜视野，用Image J软件进行分析，计算平均光密度值（AOD）；AOD=累积光密度值（IOD）/目标区域的面积（Area）。IOD值与目的蛋白表达量成正比。1.9统计学方法采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数标准差（x s）表示，两组间比较釆用独立样本t检验，以P0.05为差异有统计学意义。曾清清,等.高盐诱导高血压大鼠心肌间质重构及SHIP-1和IL-6的表达研究 55广西医科大学学报2023 Jan；40（1）2结果2.1两组大鼠一般情况及收缩压变化对照组大鼠