高效液相色谱串联质谱法测定黄芩中的植物内源激素_智绪.pdf

智绪，金桂花，吴桐彬，王月新，陈云，阚苏立（南京江北新区生物医药公共服务平台有限公司，江苏南京 211899）摘要：为了研究植物内源激素对黄芩生长的影响，建立了同时测定黄芩中赤霉素3、脱落酸、吲哚乙酸和顺式玉米素4种植物内源激素含量的液相色谱串联三重四极杆质谱的测定方法。对该方法进行优化和验证，结果表明，以Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm150.0 mm3.5 m）为色谱柱；以0.1%甲酸水为水相，甲醇为有机相梯度洗脱；流速为0.6 mL/min；柱温为30；进样量为20L；进样盘温度为4；离子源为ESI，正负采集模式；检测方式为多反应监测（MRM）方式；采用液相色谱串联三重四极杆质谱仪，以目标离子对进行定性和定量分析。在此条件下，4种植物内源激素在0.5500.0 ng/mL内线性关系良好，相关系数（R）大于0.995，检出限为0.1 ng/mL，定量限为0.5 ng/g，回收率为93.5%111.4%，相对标准偏差（RSD）小于10%，均符合验证要求。该方法快速简便，灵敏度高，可用于黄芩中4种植物内源激素的快速测定，为中药材质量提供有力保障。关键词：植物内源激素；黄芩；液相色谱串联三重四极杆质谱中图分类号:O657文献标志码:C文章编号:1004-0439（2023）01-0051-06Determination of plant endogenous hormones in Scutellaria by high-performance liquid chromatography-mass spectrometryZHI Xu,JIN Guihua,WU Tongbin,WANG Yuexin,CHEN Yun,KAN Suli(Nanjing Jiangbei New District Biomedical Public Service Platform Co.Ltd.,Nanjing 211899,China)Abstract:In order to study the effects of plant endogenous hormones on the growth of Scutellaria baicalensis,a liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry(LC-MS)was developed forthe simultaneous determination of four plant endogenous hormones in Scutellaria baicalensis.The method isoptimized and validated.The results showed that the method was performed on a Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm150.0 mm3.5 m)column by using 0.1%formic acid and methanol as mobile phases with gradientelution.The detection method used that the flow rate was 0.6 mL/min,the column temperature was 30,the injection volume was 20 L,the sample tray temperature was 4,the ion source was the electrosprayionization(ESI),positive and negative acquisition mode,and multiple reaction monitoring(MRM)mode.Qualitative and quantitative analysis was performed with target ion pairs.Under these conditions,the linear range ofthe four endogenous hormones was 0.5500.0 ng/mL,the correlation coefficient(R)was greater than 0.995,the limit of detection was 0.1 ng/mL,the limit of quantitation was 0.5 ng/g,the recoveries were 93.5%111.4%,and the relative standard deviation(RSD)was less than 10%,all meeting the verification requirements.The method is fast,simple,and highly sensitive.It can be used for the rapid determination of fourplant hormones in scutellaria and provides a strong guarantee for the quality of Chinese Herbal Medicines.Key words:plant endogenous hormones;Scutellaria;liquid chromatography-tandem triple quadrupolemass spectrometry收稿日期：2021-12-10作者简介：智绪（1991），女，工程师，硕士，研究方向为小分子化合物色谱质谱分析及其质量控制。通信作者：阚苏立（1986），男，高级工程师，博士，研究方向为小分子化合物色谱质谱分析及其质量控制。高效液相色谱串联质谱法测定黄芩中的植物内源激素印 染 助 剂TEXTILE AUXILIARIESVol.40 No.1Jan.2023第40卷第1期2023年1月印染助剂40卷植物内源激素是在植物体内合成的具有信号作用的微量有机物，由植物组织代谢合成，以微量浓度作用于特定的蛋白质受体，调节植物的生长发育。目前常见的植物内源激素主要有生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯、脱落酸。其中，生长素、赤霉素、细胞分裂素属于生长促进剂，脱落酸和乙烯则属于生长抑制剂1-2。黄芩是唇形科多年生草本植物，在药材市场的需求量极大，是40种大宗药材之一，具有止血、泻火解毒和清热燥湿等药用功效3。然而，随着耕作环境的变化，黄芩的生产量日益降低，提高产量成为亟需解决的问题。同时，不同产地的生长环境各异，还会导致黄芩药效的不同，这主要是因为外在的生态环境会影响活性代谢产物的积累。因此，研究黄芩各部位的植物内源激素含量变化，不仅有益于了解黄芩生长发育周期的各种生理变化，而且对于引导调节黄芩生长发育过程中的生长环境也非常有意义4-6。然而植物内源激素在药用植物的体内含量极低，故建立高效快速、准确检测植物内源激素的分析方法，成为激素研究领域重要的技术工作。目前，测定植物内源物质的方法主要有生物鉴定法、免疫学方法、理化检测法、色谱法7-8和液质联用法9-11。由于植物内源激素性质不稳定，对外界环境条件敏感，容易受其他化合物的干扰。因此，液质联用法逐渐成为高效检测植物内源激素的首选方法。液质联用法不仅可以准确定量分析植物内源激素，同时具有样品处理简单、专一性强、灵敏度高、快速简便等特点，适用于复杂基质样品分析，在激素分析研究方面受到越来越多的关注12-14。本实验通过液相色谱串联三重四极杆质谱仪，建立快速准确检测黄芩中4种植物内源激素的分析方法，灵敏度高、专属性好。1实验1.1材料乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merck公司），甲酸（色谱纯，ACS公司），超纯水（Miliq纯水仪自制），脱落酸（ABA，纯度98%）、赤霉素3（GA3，纯度90%）、吲哚乙酸（IAA，纯度 98%）、顺式玉米素（c-Zeatin，纯度98%）（上海源叶生物科技有限公司），黄芩植株（商洛天士力公司药源种植基地）。1.2仪器U3000超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），ZORBAX SB-C18 色谱柱（美国 Agilent 公司），Qtrap 6500+三重四极杆离子肼质谱仪（美国Sciex公司），百万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Centrifuge 5427 R冷冻离心机、ThermoMixer C恒温混匀仪（德国eppendorf公司），氮吹仪（ANPEL公司）。1.3植物内源激素标准溶液的配制分别准确称取脱落酸、赤霉素 3、吲哚乙酸以及顺式玉米素标准品适量，用甲醇溶解并稀释成 0.5mg/mL的标准储备液，低温避光保存。取标准储备液逐级稀释制备成所需质量浓度的标准溶液。1.4黄芩样本的制备取黄芩的叶和块茎用清水冲洗干净，分别保存于液氮中冷冻干燥；在液氮环境下研磨成粉末；称取粉末 250 mg，加入 2.5 mL 提取溶剂 V（异丙醇）V（水）V（浓盐酸）=2 000 1 000 2，在4、100 r/min下振荡30 min，加入5 mL二氯甲烷，继续振荡30 min；在4、13 000 r/min下离心5 min，用巴斯德移液管吸取下层有机相至刻度管中，在避光条件下用氮吹仪浓缩至微量，用甲醇溶解并定容至 500 L，经 0.22m有机滤膜过滤后进样分析。1.5分析方法1.5.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm150.0mm3.5 m）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为甲醇；梯度洗脱：01.0 min，20%流动相 B，1.03.0 min，20%50流动相 B，3.09.0 min，50%80流动相 B，9.010.5 min，80流动相 B，10.510.6 min，80%20流动相B，10.613.5 min，20流动相B；柱温：30；流速：0.6 mL/min；进样量：20 L；进样盘温度：4。1.5.2质谱条件离子源为ESI（），检测方式为多反应监测（MRM）方式。正离子质谱条件：喷雾电压4 500 V，离子源温度550，气帘气压力 35 psi，喷雾气压力50 psi，辅助气压力60 psi，驻留时间100 ms。负离子质谱条件：喷雾电压-4 500 V，离子源温度550，气帘气压力35 psi，喷雾气压力50 psi，辅助气压力60 psi，驻留时间100 ms。2结果与讨论2.1方法优化2.1.1质谱条件常用的质谱离子源有电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），每种接口均有正负 2 种采521期集模式，实验优化了 2 种接口和相应的离子监测模式。研究发现，与 APCI离子源相比，4种植物内源激素在 ESI 离子源监测下电离效果好，峰信号响应较高15。由于ESI离子源对强极性或者中等极性的物质分析效果较好，通过分析4种植物内源激素的结构，可知其均有较强的极性，更适用于ESI离子源，与实验结果一致。在 ESI离子源下，优化正负 2种采集模式，通过比对发现，GA3和ABA在负离子模式下响应较高，c-Zeatin 和 IAA 在正离子模式下响应较高。依次优化碰撞电压（CE），得到 4种植物内源激素稳定的二级碎片，选定最强碎片作为定量离子，次强碎片作为定性离子，继续优化碰撞电压和去簇电压（DP），得到每个二级碎片的优化CE和DP，最终获得优化的质谱条件如表1所示。2.1.2色谱条件色谱柱、流动相种类和比例在色谱分离中起着非常重要的作用。Ma Z等16-17研究发现，以甲醇-水作为流动相，植物内源激素的分离效果不佳，因此，为了改善分离效果，需要加入合适浓度的甲酸，甲酸不仅可以调节流动相的pH，在色谱柱分离作用下，能够形成较窄对称的峰型，同时有益于植物内源激素在质谱条件下的电离，增强信号强度，提高灵