高效液相色谱法同时测定还脑益聪方中7种人参成分含量_刘慧.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：山东省自然科学基金青年基金（）；中国博士后科学基金面上资助项目（）；北京市自然基金面上项目（）作者简介：刘 慧（），女（汉族），山东聊城人，山东中医药大学硕士研究生，主要从事中药复方及药理毒理研究工作通讯作者简介：梁晓东（），男（汉族），山西大同人，山东中医药大学副教授，博士学位，主要从事中药理论及复方药理、毒理研究工作高效液相色谱法同时测定还脑益聪方中 种人参成分含量刘 慧，唐心恬，娄慧慧，梁晓东，（山东中医药大学，山东 济南；中国中医科学院西苑医院老年病研究所，北京）摘要：目的 建立高效液相色谱法（）同时测定还脑益聪方中人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）种化学成分的含量。方法 采用 色谱柱（，），以乙腈（）水（）为流动相，进行梯度洗脱，检测波长 ，柱温 ，流速 ，进样量为 。结果 还脑益聪方中人参 、的含量分别为 、，较人参阴性样品明显升高，而 、的含量分别为、，较人参阴性样品降低。结论 建立的 法稳定可靠，重复性好，可用于还脑益聪方中质量控制评价。关键词：高效液相色谱法；还脑益聪方；人参；含量变化 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：（），（），（），（），（），（），（）（）（，），：；阿尔兹海默病（，）又称老年痴呆，是一种多发于老年患者的慢性中枢神经障碍性疾病，其起病隐匿，呈缓慢性、不断加重的神经系统衰退现象，临床特征主要表现为记忆力、语言表达能力、计算力、日常生活能力的不断减退以及情感和行为异常。随着我国的人口老龄化问题加剧，老年痴呆患者发病率也在不断升高，寻找该病的有效治疗方法是一项亟待解决的难题。中医治病讲求辨证论治、整体观念，中药的配伍使用在治疗该病时有较好效果。还脑益聪方是课题组在多年研究的基础上，依据阿尔茨海默病（）“虚 瘀 浊 毒”的中医病机理论而组成的方剂。该方由制何首乌、人参、石菖蒲、黄连、川芎组成，具有改善和提高老年认知障碍的作用。有研究发现人参是治疗老年痴呆的使用高频次药物之一。人参为方中臣药，具有安神益智、大补元气、补脾益肺、补气生血之功效。现代研究表明，人参皂苷的多种单体均对 有一定治疗作用，如人参皂苷（）可提高脑内突触素的表达，可能通过调节单胺类神经递质的含量改善大鼠的学习记忆能力，治疗；人参皂苷（）可激活 抗氧化信号通路从而降低 诱导的氧化应激压力，通过 依赖方式抑制细胞凋亡信号调节激酶（）信号通路发挥神经保护作用。为了探究还脑益聪方中人参配伍前后成分含量的变化规律，本实验采用高效液相色谱法（）考察人参单体样品和其在还脑益聪方中配伍中代表性成分人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷（）、人参皂苷、人参皂苷（）、人参皂苷、含量的变化，以期为进一步探究人参在还脑益聪方中作用机理和物质基础提供依据。仪器与材料 仪仪器器 型高效液相色谱仪（）；型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；时珍国医国药 年第 卷第 期 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。药药品品与与试试剂剂 （纯度，批号 ）、（纯度，批号 ）、（纯度，批号 ）、（纯度，批号 ）、（纯度，批号 ）、（纯度，批号 ）、（纯度，批号 ）均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；乙 腈（色 谱 纯，批 号：）、甲 醇（色 谱 纯，批 号），均购于国药集团化学试剂有限公司；甲酸（色谱纯，批号），购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。制何首乌，为蓼科植物何首乌 块根的加工品，产于四川，批号：；红参，为五加科植物人参 根 的 加 工 品，产 于 吉 林，批 号：；黄连，为毛茛科植物黄连 的干燥根茎，产于四川，批号：；川芎，为伞形科植物川芎 的根茎，产于四川，批号：；石菖蒲，为天南星科植物石菖蒲 的干燥根茎，产于湖北，批号：。以上中药材购于河北百草康神药业有限公司，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定，符合 年版中华人民共和国药典标准。方法 色色谱谱条条件件 色谱柱：色谱柱（，）；流动相：乙腈（）水（），梯度洗脱（，；，；，；，）；柱温：；进样量：；检测波长：；流速：。供供试试品品溶溶液液制制备备 混混合合对对照照品品溶溶液液 精密称定 、对照品，加甲醇制得质量浓度分别为 、，即得混合对照品溶液。红红参参供供试试品品溶溶液液 取本品粉末约 （四号筛），精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入 锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇 ，密塞，放置过夜，超声处理（功率 ，频率），滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液 ，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。还还脑脑益益聪聪方方供供试试品品溶溶液液 精密称取制何首乌 、红参 、石菖蒲 、黄连 、川芎 ，置圆底烧瓶中，以总药量计，按照 加入 乙醇，回流提取三次，每次提取 ，将 三 次 提 取 液 混 合，过 滤，加 乙 醇 定 容 至，取出 于蒸发皿中蒸干，用水溶解，上 大孔吸附树脂，首先用水进行洗脱，弃掉，乙醇进行洗脱，搜集洗脱液，至点薄层板洗脱液中无皂苷为止。将 乙醇洗脱液浓缩，继而用 乙醇定容至 ，过滤，取续滤液过 微孔滤膜，即得。结果 专专属属性性实实验验 分别取对照品溶液、红参供试品溶液和还脑益聪方供试品溶液各 ，按“”项下色谱条件测定，记录色谱图，如图。由图 可知，对照品色谱图与供试品色谱图在相同保留时间处有相应色谱峰出现，各待测成分与相邻成分均能基线分离，说明本方法专属性好，符合含量测定要求。标标准准曲曲线线绘绘制制 分别吸取“”下的混合对照品溶液精密移取 、置于 量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，配成混合对照品系列溶液，按“”项下色谱条件，各取 进样，以对照品溶液的质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）进行线性回归，得到 种成分的线性回归方程，见表。由表 结果可知各成分在相应浓度范围内线性关系良好。混合对照品溶液（）；红参供试品溶液（）；还脑益聪方供试品溶液（）；人参皂苷（）；人参皂苷（）；人参皂苷（）；人参皂苷（）；人参皂苷（）；人参皂苷（）；人参皂苷（）图 还脑益聪方 色谱图表 种成分的线性关系考察（?）成分回归方程相关系数 线性范围 精精密密度度试试验验 精密吸取“”项下红参供试品溶液，分别重复进样 次，按“”项下色谱条件测定峰面积，结果 、的 分别为 、，表明方法精密度良好。重重复复性性试试验验 取“”项下红参样品平行制备 份供试品溶液，按“”项下色谱条件测定，结果 、的 分别为 、，表明方法重复性良好。稳稳定定性性试试验验取“”项下红参供试品溶液 份，分别放置、后，按“”项下色谱条件进样检测，记录色谱峰面积，结果、的 分别为 、，表时珍国医国药 年第 卷第 期 明供试品溶液稳定。加加样样回回收收率率试试验验 精密量取已知含量的还脑益聪方供试品溶液 份，每份，准确加入一定量的、对照品粉末，按供试品溶液制备方法制备后，按“”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表。样样品品含含量量测测定定 取“”项下红参供试品溶液、还脑益聪方供试品溶液，按“”项下色谱条件测定峰面积，计算红参及还脑益聪方中 种人参化学成分含量，结果见表。表 还脑益聪方 种人参化学成分加样回收率成分样品含量 加标量 测得量 回收率 平均回收率 表 红参及还脑益聪方中成分含量测算样品 红参 还脑益聪方 讨论 发病机制是在脑内淀粉样变性形成神经毒素的淀粉样蛋白。淀粉样蛋白含有不溶性的氨基酸和矿物质、重金属以及坏死的神经细胞纤维物，。正常情况下，氨基酸在 值为 的血液和体液中可以溶解；只有在酸性介质中，会形成不溶性的胶质狀。因此，局部酸化的部位会逐渐形成淀粉样蛋白沉积。而要使不溶性的氨基酸变成可溶性的氨基酸，必须要将局部酸性恢复成碱性，。有研究发现使用还脑益聪方可以改善淀粉样前体蛋白 早老蛋白（）双转基因小鼠学习记忆能力，还对脑组织 淀粉样蛋白和 蛋白的沉积有抑制作用。本研究通过 检测中药复方还脑益聪方中人参 种组分的含量，结果发现复方中红参 、的含量较红参阴性样品明显升高，而 、的含量降低，提示还脑益聪汤配伍有利于 、种成分的溶出。而 、属于偏碱性苷类，、属于偏酸性苷类，由此推测还脑益聪汤配伍可能抑制偏酸性苷类成分溶出，促进中性和碱性成分溶出，从而产生疗效。人参具有开窍益智的作用，人参皂苷是人参的主要活性物质，具有抗氧化、保护神经细胞，治疗 的作用，。同时有研究表明，口服人参片或其提取物对患者和不同动物模型的认知能力都有好处，。临床实验表明 患者给予七生力片（主要成分是 ），患者的、均有明显提高，治疗有效率为。能显著改善东莨菪碱诱导的阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆功能，人参皂苷 联合 细辛醚可以改善 模型小鼠的学习记忆能力，且效果优于各化合物单用。本研究中，三种成分的含量升高，提示此三种物质可能为还脑益聪方中人参抗老年痴呆潜在的主要物质基础。本实验建立的 还脑益聪方中 中人参成分含量同时测定方法，稳定可靠，重复性好，可为还脑益聪方质量控制评价提供新的技术方法。参考文献：黄 鑫，高旭东，梁剑平，等 阿尔兹海默病致病机制及环境对其发病影响 西北民族大学学报（自然科学版），（）：矫增金，陈 民 论老年性痴呆中医病因病机 辽宁中医药大学学报，（）：刘明芳，李 浩，刘剑刚，等 还脑益聪方提取物对不同月龄 转基因小鼠行为学及其海马区线粒体超微结构的影响 中国中药杂志，（）：李 浩，刘 芳，徐立然，等 还脑益聪胶囊对老年轻度认知障碍的影响 中国中西医结合杂志，（）：刘 根，贺文彬，赵子强，等 基于中医传承辅助平台对老年性痴呆防治方剂核心药物组合的筛选研究 中国实验方剂学杂志，（）：杨岩涛，赵佳柱，肖佳妹，等 人参皂苷治疗阿尔茨海默病的药理作用研究进展 中国药理学通报，（）：，（）：，（）：张贺奡，庆 宏 阿尔茨海默症发病机制及治疗方法研究进展科技导报，（）：，：，（）：郭一博，石镜明，刘 航，等 以 淀粉样蛋白作为阿尔茨海默症治疗靶点的研究进展 解剖学杂志，（）：崔 婧 人参皂苷 抗阿尔茨海默病的作用及其机制研究东北师范大学博士学位论文，刘美霞，周丽娟，石丹丹，等 还脑益聪方提取物改善淀粉样前体蛋白 早老蛋白 双转基因痴呆小鼠学习记忆能力的机制研究世界中医药学会联合会老年医学专业委员会、中国中西医结合学会慢病防治与管理专业委员会 学术年会论文摘要集，：王晓宁，李 浩，刘剑刚，等 还脑益聪方对老年认知障碍大鼠学习记忆及脑组织 淀粉样蛋白和 蛋白表达的影响 中国老年学杂志，（）：楚生辉 人参有效成分分析及其对阿尔茨海默病的影响 安徽农业大学博士学位论文，时珍国医国药 年第 卷第 期 何丽玲，艾亚婷，胡慧 基于网络药理学探讨人参 石菖蒲治疗轻度认知损害的作用机制 时珍国医国药，（）：，（）：，（）：李琼锋，郭翔兵 七生力片治疗老年性痴呆 例 福建中医药，（）：商崇智，赵明亮 人参皂苷 对东莨菪碱诱导阿尔茨海默病小鼠学习记忆的影响 中华实用诊断与治疗杂志，（）：邓敏贞，钟晓琴，高志杰，等 人参皂苷 联合 细辛醚对血管性痴呆模型小鼠的改善作用及其机制研究 中国药房，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：中药材生产技术标准制定合同项目（）号作者简介：覃春叶（），女（苗族），贵州遵义人，贵州中医药大学在读硕士研究生，主要从事中药及民族药资源分类鉴定与质量控制工作通讯作者简介：李 玮（），男（汉族），湖南邵东人，贵州中医药大学教授，学士学位，主要从事中药炮制原理及技术研究工作通讯作者简介：杜洪志（），男（汉族），贵州毕节人，贵州中医药大学讲师，博士学位，主要从事中药炮制原理及技术研究工作综合评分法优选黔产钩藤的产地加工方法覃春叶，范佐万，吴昭会，杜洪志，李 玮，吴珊珊，林 昶（贵州中医药大学，贵州 贵阳）摘要：目的 优选黔产钩藤的最佳产地加工方法。方法 分别采用阴干、晒干、烘干、蒸制、烫制法加工钩藤，以钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、缝籽嗪甲醚、去氢毛钩藤碱