枸杞内生真菌NQ8GⅡ4定殖促生作用研究_李金.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(3):4 7 9-4 8 7A c t aA g r i c u l t u r a eB o r e a l i-o c c i d e n t a l i sS i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 6h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 6枸杞内生真菌N Q 8 G 4定殖促生作用研究收稿日期:2 0 2 1-1 0-0 4 修回日期:2 0 2 1-1 1-1 5基金项目:国家自然科学基金(3 1 4 6 0 4 8 4);宁夏回族自治区重点研发项目(2 0 1 9 B B F 0 2 0 1 3)。第一作者:李 金,男,硕士研究生,从事生物防治与菌物资源利用研究。E-m a i l:2 4 2 1 5 3 3 6 6 8q q.c o m通信作者:顾沛雯,女,教授,博士生导师,研究方向为植物病理学及植物内生菌。E-m a i l:g u p e i w e n 2 0 1 9n x u.e d u.c n李 金,闫思远,陈思杰,顾沛雯(宁夏大学 农学院,银川 7 5 0 0 2 1)摘 要 为进一步明确内生生防菌NQ 8 G4在宿主和非宿主植物中的定殖能力和促生作用,采用生物学方法测定野生型NQ 8 G4菌株的促生潜力;利用绿色荧光蛋白(G F P)标记的NQ 8 G4-G F P菌株,对枸杞、番茄、小麦、西葫芦、生菜和芹菜等6种植物进行灌根处理,利用激光扫描共聚焦显微镜观测NQ 8 G4-G F P菌株在宿主和非宿主植物中的定殖情况,同时检测不同接种浓度对枸杞苗生长的影响。结果表明,野生型NQ 8 G4菌株在5d时赤霉素浓度可达1 6.6g/m L,并具有一定解磷、产铁载体、纤维素酶和蛋白酶的能力。NQ 8 G4-G F P菌株能定殖于枸杞、番茄和小麦的根部,不能定殖于芹菜、生菜和西葫芦。不同植物定殖率有明显差异,在宿主植物枸杞根部定殖率最高,为9 3.9%,在非宿主植物番茄根部定殖率为9 1.8 4%,而在小麦根部定殖率仅为2 1.4 3%。不同接种浓度下对枸杞苗生长指标影响不同,其中以1 051 06C F U/m L孢子液灌根,对枸杞苗促生作用显著,在农业上具有良好的应用前景。关键词 内生真菌NQ 8 G4;绿色荧光蛋白;定殖;促生作用 植物内生真菌是指生活史的全部或某一阶段定殖于植物体内,但对宿主植物不造成明显病害症状的一类真菌1。有益内生真菌的定殖能够促进宿主植物生长,增强宿主抗逆抗病能力,而内生真菌发挥促生和防病作用的前提是与植物建立良好共生关系2-3。目前,用于检测内生真菌在植物体内定殖的方法有基因标记法4、抗生素标记法5、同位素示踪法6、核酸探针法7和免疫学等方法8。报告基因技术的发展为研究内生真菌在植物中定殖和互作关系提供了极大的便利。绿色荧光蛋白(G r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n,G F P)易于检测、对细胞无毒害、表达稳定,在多种生物细胞中均可表达,使其成为广泛应用的分子标记之一9。丁婷等1 0利用G F P标记,观察发现杜仲内生真菌D Z J 0 7-6可在小麦根和茎组织的细胞间隙和细胞内大量定殖;陈楠等1 1利用G F P标记的碱蓬内生真菌J P 4-1转化子侵染水稻幼苗,并在荧光显微镜下示踪J P 4-1菌株及其侵染特性。枸 杞 内 生 真 菌NQ 8 G 4(专 利 号:C N 2 0 2 0 1 0 3 5 7 0 4 6.4)分离自 宁杞8号 健康枸杞的根部,经鉴定为轮状镰刀菌(F u s a r i u mn e m a-t o p h i l u m)。胡丽杰等1 2研究表明,NQ 8 G4菌株对枸杞胶孢炭疽菌(C o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o-r i o i d e)的抑制率高达9 3.4 3%,生防菌菌丝能缠绕并穿 透 胶 孢 炭 疽 菌 菌 丝,使 菌 丝 膨 胀 崩 解。NQ 8 G4菌株的发酵滤液对红枣、葡萄等果品的致腐病原真菌具有明显的抑菌作用,能大大降低红枣贮存期间的腐烂速率,延长货架期1 5d左右1 3。闫思远等1 4研究发现,NQ 8 G4菌株仅能定殖于枸杞根部,并成功构建NQ 8 G4菌株的遗传转化体系,获得1株与野生型性状一致的G F P标记转化子NQ 8 G4-G F P菌株。为明确NQ 8 G4菌株的定殖和促生作用,本试验采用生物学方法测定野生型NQ 8 G4菌株的促生潜力,研究NQ 8 G4-G F P菌株在不同植物根部的定殖情况及对其枸杞的促生作用,以期为该生防菌株作为微生物肥料的开发及应用提供依据。1 材料与方法1.1 供试植物供试种子分别为 宁杞5号 枸杞(宁夏农林科学院枸杞研究所)、绿秀5号 西葫芦(上海汇阳种业有限公司)、宁春4号 小麦(宁夏科丰种业有限公司)、加州王 芹菜(宁夏科泰种业有限公司)、大速生 生菜(青丰种业有限公司)和 白砂糖 番茄(寿光金鹏种业有限公司),上述种子经消毒(7 5%酒精,3 0s;1%N a C l O,5m i n)后栽种到装有已消毒营养土和蛭石(二者等体积混合)的7 2孔穴盘(5 4c m2 8c m4.5c m)内,于光照培养箱(R Q X-2 5 0,上海恒宇公司)中2 6、1 2h光照/1 2h黑暗交替培养培育至3 5片真叶,备用。1.2 菌 种野生型NQ 8 G4菌株,由胡丽杰1 5从健康枸杞根部分离获得;G F P标记菌株NQ 8 G4-G F P由闫思远等1 6通过P E G介导的原生质转化获得,菌种均保存于宁夏大学农学院植物病理学实验室。1.3 野生型菌株促生活性测定1.3.1 菌株产赤霉素活性 将NQ 8 G4菌株接种于P D B液体培养基,摇菌5d后利用福林法1 7初步鉴定NQ 8 G4产赤霉素能力。定量测定:参 考 刘 文 芳1 8的 方 法 建 立 标 准 曲 线y=0.9 2 48x+0.0 3 13(R2=0.9 9 5),式中y为6 8 0n m处 的 比 色 值,x为 赤 霉 素 含 量(g),将NQ 8 G4孢子液比色后测定A 6 8 0n m,通过与标准曲线比对计算出NQ 8 G4菌株产赤霉素的浓度。1.3.2 菌株产铁载体能力 定性分析:参考汪少林1 9的方法,吸取5 0L的NQ 8 G4菌株去铁查氏培养滤液与等体积的C A S检测液混匀,以混合液变为(橙)红色为标准判断是否具有产铁载体活性。定量测定:将NQ 8 G4菌株的菌液接种至去铁查氏培养基中摇床培养7d,将菌液上清液与等体积C A S检测液混合后测定6 3 0n m波长下的比色值(As),用同样的方法测定空白去铁查氏培养液比色值(Ar),以As/Ar分级标准2 0表示产铁载体能力。1.3.3 菌株解磷、产蛋白酶和纤维素酶定性分析 选择培养基的配制参照文献2 1-2 3,将NQ 8 G4菌株接种到改良P VK无机磷培养基、蒙金娜有机培养基、蛋白酶培养基和羧甲基纤维素钠培养基上,2 8培养5d后,通过观察透明圈的大小,判断解磷、产蛋白酶能力。羧甲基纤维素钠培养基则经刚果红染色后,观察降解圈的形成情况判断产纤维素酶活性。1.4 G F P标记菌株在植物根部的定殖1.4.1 接种 NQ 8 G4-G F P菌株孢子液的制备参考张誉荠等2 4的方法,血球计数板调整浓度为1 07C F U/m L。选取长势一致的枸杞、番茄、小麦、芹菜、西葫芦和生菜苗,每株幼苗分4次沿根围浇灌2 0 0m L的NQ 8 G4-G F P菌液,以无菌水为对照处理,每处理设置6个重复,参照“1.1”条件培养5 0d后用于定殖研究。1.4.2 激光扫描共聚焦显微镜观察 随机取处理后的各植物根段若干,洗净后徒手切片,制成水玻片,利用激光扫描共聚焦显微镜(S P 5,德国莱卡公司)在蓝光(4 8 8n m)下观察菌株在植物中的定殖,以无菌水处理的植物为空白对照。1.4.3 定殖率测定 参考李晓慧等2 5的方法,使用P D A检测法测定NQ 8 G4-G F P标记菌株在各植物根部的定殖率,P D A检测培养基中添加5 0 m g/L Am p和3 0 m g/L Hm B,用 于 筛 选NQ 8 G4-G F P标记菌株。样品材料进行表面消毒(方法同“1.1”),每个培养皿均匀摆放9块根样,2 8培养,7d后观察并记录植物根段上菌体生长情况,定殖率=出现目标菌落的根段数量/根段总数1 0 0%,每个处理重复3次。1.5 N Q 8 G4-G F P菌株对枸杞的促生作用按照“1.4.1”的方法配制1 07C F U/m L的NQ 8 G4-G F P孢子液,稀释成1 06、1 05、1 04和1 03C F U/m L。枸杞苗栽培培养方法同“1.1”,待枸杞苗长至3片真叶后进行灌根处理,每株幼苗分3次沿根围浇灌1 5 0m L的孢子液,以等体积无菌水处理作为对照,每个处理设置9个重复。浇灌3 0d后,测量不同接种浓度下枸杞苗株高、根长、叶数、叶面积(长宽)、根鲜质量和干质量等生长指标,并测量最佳接种浓度下枸杞苗叶片的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和根系活力等生理指标,每个处理重复6次。叶绿素、可溶性糖含量和根系活力用相关试剂盒测定,可溶性蛋白含量参照蔡庆生2 6的方法,采用考马斯亮蓝法测定。1.6 数据处理使用S P S S2 3.0对试验数据进行分析,采用单因素方差分析(o n e-w a yANOVA)和事后L S D检验 比 较 不 同 处 理 之 间 的 显 著 性 差 异(=0.0 5)。两两比较采用t检验,以P0.0 1为差异显著。2 结果与分析2.1 野生型N Q 8 G4菌株的促生活性产赤霉素定性试验表明,在加入福林试剂后,084西 北 农 业 学 报3 2卷野生型NQ 8 G4菌株的发酵液呈浅绿色(图1-A 6),与空白对照的黄色(图1-A 1)对比明显,表明NQ 8 G4菌株具有产赤霉素的能力。进一步定量分析表明,NQ 8 G4菌株培养5d的发酵滤液中赤霉素含量可达1 6.6g/m L。产铁载体定性分析显示(图1-B),NQ 8 G4菌株培养滤液与C A S检测液反应呈橙红色,而空白对照则呈现蓝色,表明NQ 8 G4菌株具有分泌铁载体能力。铁载体定量检测As/Ar值为0.7,根据分级标准判定其产铁载体能力为中等。NQ 8 G4菌株均可在测定解磷(无机磷和有机磷)、产蛋白酶和产纤维素酶的4种选择培养基上生长,在无机磷P VK培养基上未观察到透明圈(图2-A),而在蒙金娜有机培养基、蛋白酶培养基能够观察到明显的透明圈(图2-B2-C),在羧甲基纤维素钠培养基可见较明显降解圈(图2-D),上述现象 说明NQ 8 G4菌株具有一定解有机磷、产蛋白酶和纤维素酶的能力,对植物可能有促生活性。A.赤霉素福林法比色,15分别为0m g、0.0 4m g、0.0 8m g、0.1 6m g、0.3 2m g的赤霉素标准比色液,6为NQ 8 G4发酵滤液比色;B.铁载体定性检测;C K.空白对照A.G i b b e r e l l i nc o l o r i m e t r i cm e t h o d,1-5a r e0m g,0.0 4m g,0.0 8m g,0.1 6m g,0.3 2m gg i b b e r e l l i ns t a n d a r dc o l o r i m e t r i cs o l u-t i o n,6.c o l o r i m e t r yo fNQ 8 G4f e r m e n t a t i o nf i l t r a t e;B.S i d e r o p h o r eq u a l i t a t