钩藤炭疽病生物学特性研究_邓洁.pdf

第 1 期第 53 卷基金项目：黔东南州科技计划项目“剑河钩藤主要病原物生物学特性及绿色防控技术的研究”（黔东南科合字2019105 号）作者简介：1.邓洁（1984.11），男，汉族，贵州凯里人，硕士，凯里学院，实验师，研究方向：植物病理研究2.彭舒（1986.04），女，苗族，贵州省天柱县人，硕士，凯里学院，副教授，研究方向：植物基因工程及园艺植物品质调控邮箱：钩藤炭疽病生物学特性研究邓洁，彭舒凯里学院，贵州凯里市，556011摘要：钩藤是常绿藤本，属茜草科药用植物，具有很高的药用价值。文章就剑河钩藤较为严重的炭疽病进行病原菌分离，并对其中分离出的葡萄座腔菌进行生物学特性研究。通过病叶接种、分离纯化、病原菌鉴定、葡萄座腔菌的生物学特性研究，得出最适合萄座腔菌的生长环境，即温度在30 左右，喜光，偏酸性，pH 在 5 左右，最适碳源为果糖、最适氮源为蛋白胨和酵母浸粉，以为钩藤炭疽病的绿色防控提供理论支撑。关键词：钩藤；葡萄座腔菌；炭疽病；生物学特性doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.01.0141研究意义钩 藤（Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq.exHavil.）以带钩的茎枝入药，具有治疗抽搐、止咳、透疹、调节心率、降血压等多种功效1，具有很高的药用价值2。本文针对从为害较重的炭疽病发病部位上分离出的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）进行相应的实验，探究该菌的生物特性，讨论其与钩藤炭疽病的侵染关系，为钩藤炭疽病的防治打下基础，找出防治突破点。2研究方法2.1病原菌鉴定采集剑河钩藤为害较重的病害，分离纯化得到纯培养菌，之后测序鉴定菌种，并对病害部位进行显微镜观察，结合病原菌形态及测序结果进行鉴定。2.2温度对病原菌的影响实验处理温度为 5 40，每隔 5 为一处理。在超净工作台下，用高压灭菌的 0.5 cm 打孔器接种菌种菌饼于 PDA 培养基中央，分别放入上述温度的培养箱无光照培养，每一温度培养 3 个培养基，用“米字法”每隔 24 h 记录一次菌落直径3。2.3光照对病原菌的影响实验处理光照为无光照、全光照、交替光照（12 h光照、12 h 无光照）、自然光照 4 组，每一光照条件培养 3 个培养基，用“米字法”每隔 24 h 记录一次菌落直径4。2.4pH 对病原菌的影响实验处理为 pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH10，共 7 个梯度，以 PDA 培养基为基础，用 1 mol/L的 HCL 和 NaOH 调节 PDA 培养基的浓度，放入 27的培养箱无光照培养，每一梯度培养 3 个培养基，用“米字法”每隔 24 h 记录一次菌落直径5。2.5碳源对病原菌的影响实验处理碳源为以未放碳源的 PDA 培养基为基础，分别加入果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖，和不加碳源为对照作为培养基；放入 27 的培养箱无光照培养，每一碳源条件培养 3 个培养基，用“米字法”每隔 24 h 记录一次菌落直径。2.6氮源对病原菌的影响实验处理氮源为以未放氮源的察氏培养基为基础，分别加入蛋白胨、甘氨酸、酵母浸粉、硝酸钠，和不加碳源作为培养基；放入 27 的培养箱无光照培养，每一氮源条件培养 3 个培养基，用“米字法”每隔第 53 卷第 1 期2023 年 2 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.1Feb.202345-第 1 期第 53 卷工业微生物24 h 记录一次菌落直径。3结果与分析3.1病原菌鉴定对病叶切片，发现子囊壳呈球形，黑褐色，球面有瘤状突起。通过显微镜观察葡萄座腔菌培养菌，发现菌丝呈树状，有分叉，前期白色，后期灰白色，孢子堆淡黄色，单孢米粒状，表面光滑，无色。对菌株进行分子鉴定，测得 rDNA-ITS 序列和GenBank，与原有的 rDNA-ITS 序列相比较，通过MEGA 6.0 软件建立系统发育进化树。把得出的序列在 NCB 上与得出的序列进行 blast 比对，其与葡萄座腔菌的同源性达 99%。结合显微镜的病原菌形态特征和分子生物学，鉴定该病原菌为葡萄座腔菌。3.2温度对病原菌的影响从图 1 和图 2 中发现，在 10 35 下菌丝都可以生长，在 5 和 40 下真菌抑制生长，但未致死；在 10 下菌丝生长极其缓慢，最适生长温度在 30 左右，菌落发展速度较快，生长比较茂密；在10 30 菌落生长速度和茂密情况都呈上升趋势，而在 30 35 呈下降趋势。由此可得，葡萄座腔菌生长喜温，不耐高低温，最适温度在 30 左右。图 1温度影响葡萄座腔菌生长趋势图图 2不同温度下 6 d 后菌丝生长情况3.3光照对病原菌的影响结果发现，在无光照下培养生长缓慢，菌落单薄，且泛淡黄色；在光照处理下生长要快，菌落生长茂盛，其中 12 h 有光照、无光照交替培养最好，与全黑暗处理差别较大，交替光照处理下菌落生长速度快且茂密，与自然光照和全光照 2 组光照处理生长发展相比较好，但差距远没有全黑暗处理的大（见图3）。由此可推断葡萄座腔菌生长喜光，且昼夜交替光照最好。图 3光照影响葡萄座腔菌生长对比图3.4pH 对病原菌的影响由图 4 可以发现，在 pH 5 的培养基环境下，比在正常培养状态下（pH 7）菌落生长迅速得多，且菌落生长相对较茂密，在 pH 4、pH 6、pH 7 的培养基环境下菌落茂密和菌丝发育正常，而 pH 7 往后的培养基环境下，菌落不仅发育缓慢，而且菌丝颜色会提前变化，呈发育不良状态。在各 pH 浓度的培养环境下，pH 5 下为最适生长状态，往两边呈下降趋势，可推断葡萄座腔菌生长喜偏酸性环境，且最适值在pH 5 左右。图 4不同 pH 影响葡萄座腔菌生长趋势图3.5碳源对病原菌的影响结果发现，不加碳源导致菌落生长缓慢，菌丝只有贴着培养基生长很薄一层，且菌丝短小，发育不正常；而在果糖下培养的菌落生长迅速，菌丝茂密。从生长速度来看，在蔗糖下培养的菌落较果糖培养下的菌落生长要慢，差距不是很大，而从菌丝发育状态来看并没有明显差距。在葡萄糖和麦芽糖培养下的菌落生长速度和菌丝发育状况没有差别，与不加碳温度/9.008.007.006.005.004.003.002.001.000.0010 15 20 25 30 35 987654321045678910pH自然光照无光照全光照交替光照9.008.007.006.005.004.003.002.001.000.0046-第 1 期第 53 卷邓洁等：钩藤炭疽病生物学特性研究AbstractUncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.,an evergreen vine,is a medicinal plant of Rubiaceae family,with highmedicinal value.In this paper,we isolated the pathogen of the relatively serious anthracnose of Uncaria jianhe,and studied thebiological characteristics of Botryosphaeria dothidea isolated from it.Through inoculation of diseased leaves,isolation and purification,identification of pathogenic bacteria,and study on biological characteristics of grape stroma bacteria,it was concluded that the mostsuitable growth environment for grape stroma bacteria was:temperature at about 30,light loving,acidic at about pH5,the mostsuitable carbon source was fructose,and the most suitable nitrogen source was peptone and yeast extract.The purpose was to providea theoretical basis for the green prevention and control of Uncaria anthracnose.Key wordsuncaria;botrytis viticola;anthra cnose;biological characteristics源相比要好，但与果糖下培养相比有较大差距。所以，葡萄座腔菌生长需要碳源，且在果糖的环境下生长最好。3.6氮源对病原菌的影响结果发现，在察氏培养基中培养的葡萄座腔菌，生长情况比 PDA 培养基中培养的普遍较差。对比本次实验处理，在蛋白胨和酵母浸粉下培养的菌落生长速度和菌丝发育状况最好，且两者之间没有较大差别，所以得出结果：葡萄座腔菌生长需要氮源，且在有酵母浸粉和蛋白胨的情况下生长得最好。4结果与讨论对葡萄座腔菌进行了生物学性探究，发现温度、光照、pH、碳源、氮源都对葡萄座腔菌的生长有影响，为葡萄座腔菌的防治打下基础。实验发现，葡萄座腔菌最适生长环境：需要光照，且昼夜正常光照时长最好；需要碳源，氮源，且容易被利用生长的是果糖和酵母浸粉、蛋白胨。葡萄座腔菌的最适生长环境温度在 30，一般为夏季，喜偏酸性环境，这也解释了当地种植钩藤的环境与葡萄座腔菌适应生长的环境相符合。本实验最开始从病叶上分离的博宁炭疽菌可直接引起炭疽病，但葡萄座腔菌是否可直接引起该病，或者单独引起该病害还没有相关文献报道。（作者认为），分离出的大多数葡萄座腔菌属于内生菌，但也不排除是致病真菌造成影响，所以存在作为内生菌潜伏在植物寄主内不发病，被人忽视，而后却致病发病的情况。是否存在复合侵染情况，存在博宁炭疽菌先侵染后葡萄座腔菌再侵染导致发病的情况，或者存在葡萄座腔菌先侵染的前提下博宁炭疽菌再侵染才导致发病的情况，还需继续进行研究。参考文献1 王邦富.林下经济植物栽培 M.北京:中国林业出版社,2014:782 屈小媛,林昌虎,秦华军,等.钩藤不同部位不同时期药用成分分布规律分析 J.湖北农业科学,2016,55(3):658-6593 李文英,李夏,解开治,等.葡萄座腔菌科真菌的系统学和多样性探讨 J.生物多样性,2017,25(8):874-8854 王璠,黄俊斌,李国怀.葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)引起的果树病害及研究进展 J.植物保护,2013,39(6):7-135 张倩,李阳,杨埔,等.甜樱桃葡萄座腔菌的生物学特性研究 J.食品工业科技,2020,41(10):101-106Study on Biological Characteristics of Uncaria AnthracnoseDENG Jie，PENG ShuKaili College,Kaili City,Guizhou,55601147-