功能核酸用于致病菌检测的研究进展_赵文卓.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 30 38Current Biotechnology ISSN 2095-2341食品安全检测专题食品安全检测专题Special Forum on Food Safety Detection功能核酸用于致病菌检测的研究进展赵文卓，李成勋，胡作建，余红秀*复旦大学生物医学研究院&附属口腔医院，上海 200032摘要：由食源性致病菌引发的疾病对人类健康构成巨大威胁。虽然一些致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等在诊断和预防方面已经取得了重大进展，但开发快速、高效、低成本的检测方法仍然是一项挑战。功能核酸（functional nucleic acids，FNAs）是一类功能超出核酸常规遗传作用的核酸，主要包括天然的核酶（RNAzymes）、核糖开关（riboswitches）以及体外通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选的适配体（aptamers）、核酶（RNAzymes）和脱氧核酶（DNAzymes）。适配体和脱氧核酶因具有较高的稳定性、特异性和可设计性，使其成为病原微生物识别的理想工具，近年来在生物传感和医学诊断领域备受关注。综述了功能核酸的筛选原理和流程、适配体及具有RNA裂解活性的脱氧核酶（RNA cleavage deoxyribozymes，RCDs）在致病菌检测中的应用进展和面临的挑战，并对其未来的发展前景进行了展望。关键词：功能核酸；SELEX技术；致病菌；生物传感器DOI：10.19586/j.20952341.2022.0089中图分类号：R440 文献标志码：AResearch Progress of Functional Nucleic Acid Used in Pathogenic Bacteria DetectionZHAO Wenzhuo，LI Chengxun，HU Zuojian，YU Hongxiu*Institutes of Biomedical Sciences&Shanghai Stomatological Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，ChinaAbstract：Diseases caused by food-borne pathogenic bacteria pose a great threat to human health.Although some pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Salmonella enterica have made great progress in diagnosis and prevention，it is still a challenge to develop fast，efficient and low-cost detection methods.Functional nucleic acids（FNAs）are a kind of nucleic acids with functions beyond the conventional genetic function of nucleic acids，mainly including natural ribozymes，riboswitches，as well as aptamers，RNAzymes and deoxyribozymes screened by exponential enrichment ligand system evolution（SELEX）in vitro.Because of its high stability，specificity and designability，aptamers and DNAzymes have become an ideal tool for identifying pathogenic microorganisms，which has attracted much attention in the fields of biosensing and medical diagnosis in recent years.This paper reviewed the screening principle and process of functional nucleic acids，the application progress and challenges of aptamers and RNA cleavage deoxyribozymes（RCDs）in the detection of pathogenic bacteria，and prospected their future development prospects.Key words：functional nucleic acids；SELEX technology；pathogenic bacteria；biosensor由食源性致病菌如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella enterica）等引发的呕吐、腹泻等疾病对人类健康构成重大威胁1-2。2013年，国际食品法典委员会修订了 制定和应用食品微生物标准的原则和指南（CAC/GL 211997）3，其中规定了微生物标准的适用范围、定义和要素，以及制定标准的目的、需要考虑的因素、采样方案和收稿日期：20220526；接受日期：20220818基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFC2701802）；上海市口腔医院科技创新人才培养计划（SSH-2022-KJCX-A01）。联系方式：赵文卓 E-mail:；*通信作者 余红秀 E-mail:赵文卓，等：功能核酸用于致病菌检测的研究进展检验方法等内容，以指导各国微生物限量标准管理工作。我国 食品安全法 第26条明确规定，食品安全标准应当包括食品中致病性微生物的限量规定4。2013年，我国制定和发布了 食品中致病菌限量（GB 299212013），该标准的发布对于保障食品安全和控制食源性疾病的发生具有积极作用。开发快速且准确的检测和诊断技术不仅可以对食物中存在的致病菌进行预防，还可以帮助医生确定致病菌，从而实施快速干预和精准医疗，以改善患者的治疗效果。传统的细菌感染诊断方法包括细菌培养法5、聚合酶链式反应检测遗传物质6、免疫分析法检测细菌蛋白等。细菌培养法是一种成熟的检测方法，依赖于生物体的直接培养和铺设。但这种传统的检测方法只能有效地鉴定给定样品中的一小部分细菌且耗时较长。聚合酶链式反应不费时，可以快速获得结果，但仅可用于检测已知病原体且样品污染可能会产生误导性结果。虽然这些传统技术都为致病菌的检测作出巨大贡献，但也存在一定的缺陷，因此，建立一个可以快速简便检测病原微生物的分析方法至关重要。功能核酸（functional nucleic acids，FNAs）是核酸和核酸类似分子的通称，包括天然 FNAs和人造FNAs两种类型。其中，天然FNAs包括核酶（RNAzymes）和核糖开关（riboswitches）7，而人造FNAs 包括通过体外筛选鉴定的适配体（aptamers）、核酶（RNAzymes）和脱氧核酶（DNAzymes）。FNAs 具有独立结构、执行催化和配体结合等功能，可以取代传统的蛋白酶和抗体，执行特定的生物学非遗传功能。近年来，大量的功能核酸在治疗、成像、筛选、药物开发、材料科学、纳米技术、有机合成和传感等各个领域显示出巨大的应用潜力8-9，其中以适配体和脱氧核酶为基础，结合现代生物技术和先进物理技术的生物传感器被开发出来，可在分子水平上快速、灵敏地检测金属离子、小分子、蛋白质和细菌等。王琦等10对核酸适配体传感器检测食品致病菌的研究进展做了完整的总结和回顾，本文着重讨论了近年来功能核酸包括具有 RNA 裂解活性的 DNA 酶（RNA-cleaving DNAzymes，RCDs）在致病菌检测中的应用进展，以期为致病菌检测研发提供参考。1功能核酸的体外筛选1.1指数富集配体系统进化技术体外人工合成的功能核酸主要分成两大类：一部分是能够高特异性识别并结合靶分子的DNA或RNA分子，称为核酸适配体（aptamer）11。另一部分是依赖特定分子进行催化反应的具有酶活性的DNA分子，称为脱氧核酶（DNAzyme）12。1990年，Ellington13和 Tuerk等14通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选获得了核酸适配体。随后，通过该方法筛选出了数千种针对氨基酸、蛋白质、小金属离子、有机分子、细菌、病毒和整个细胞的功能核酸。除了传统的SELEX技术外，还包括基于磁珠的 SELEX（magnetic bead-based SELEX）15、毛细管电泳SELEX（capillary electrophoresis SELEX）16-17和 全 细 胞 SELEX（whole cell-SELEX）18等。根据筛选过程中是否进行序列的扩增富集，又将现有的筛选技术分为SELEX和 Non-SELEX。其 中 Non-SELEX 不 需 要 进 行PCR等核酸序列扩增步骤，经过23次分离直接得到筛选结果。与SELEX技术相比，Non-SELEX技术可在几天甚至几小时内完成筛选过程，但其局限性在于对毛细管电泳的要求较高，所以只适用于大分子物质的筛选19-20。SELEX 技术为功能核酸在生命科学领域的拓展和应用提供了巨大潜力。一旦确定了功能核酸的序列，就可以开发出多种生物传感器来检测目标分子。以功能核酸为基础的生物传感器可分为荧光传感器、比色法传感器和电化学传感器等，它们在临床致病菌的检测中都显示出了巨大的应用潜力。1.2适配体及其筛选原理核酸适配体通常为单链 DNA 或 RNA 短序列，通过碱基互补配对原则或静电作用等原因发生折叠，从而形成更为稳定的空间结构，这些特别的 空 间 结 构 可 以 选 择 性 地 结 合 到 目 标 分 子上21-22。适配体作为一种特殊的识别元件，功能与单克隆抗体相似，但其具备稳定性高、易化学修饰、体积小、无免疫原性和靶标多样等优点，在致病菌的快速检测中具有广阔的应用前景。目前，已有多种基于核酸适配体设计的生物传感器应用于病原微生物的检测（表1）。31生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology针对致病菌适配体的筛选方面，目标分子可以分为全细胞、脂多糖、蛋白质和芽孢等，其中以全细胞作为筛选的目标分子不需要事先明确生物标志物。随着研究的深入，致病菌的表面组分以及细菌休眠体已成为研究热点。相比于全细胞，以表面组分和芽孢作为目标分子具有缩短实验周期、降低实验安全隐患等独特优势。适配体的SELEX筛选包括7个步骤（图1）：确定目标分子；创建高容量的随机DNA或RNA文库；将DNA或RNA文库暴露于目标分子；采用特定方法分离弱结合或未结合的寡核苷酸；分离目标分子；对结合的核苷酸序列进行PCR扩增并进入下一轮筛选；通过反复的多轮筛选、分离和扩增，生成与靶分子高特异性结合的功能核酸。图1适配体筛选原理37Fig.1Screening principles of aptamer37表1基于功能核酸检测致病菌的生物传感器性能比较Table 1Performance comparison of biosensors for detecting pathogenic bacteria based on functional nu