功能红曲中莫纳可林类物质的检测_林军.pdf

2023，32（1）福建分析测试Fujian Analysis&Testing功能红曲中莫纳可林类物质的检测林 军，林 风，吴丽云*（福建省微生物研究所，福建省红曲微生物技术开发应用工程研究中心，福建福州350007）收稿日期：2022-10-31基金项目：福建省公益类科研院所专项编号（2020R10050015）作者简介：林军（1990），男，硕士/研究实习员，研究方向:微生物发酵及代谢组学，邮箱通讯作者：吴丽云（1966），女，博士/教授级高级工程师，研究方向:发酵工程。摘要：目的：分析鉴定实验室自制的功能红曲菌的固态发酵物中的主要莫纳可林类物质。方法：首先通过固态发酵制得功能红曲粉，然后分别使用极性不同的4种溶剂（蒸馏水、乙醇、乙酸乙酯和正己烷）超声提取提取功能红曲粉，再通过减压旋蒸及冷冻干燥制得提取物粉末。通过UPLC-Q-TOF-MS对功能红曲粉的不同溶剂提取物的化学成分进行定性分析与比较。采用Agilent Eclipse Plus-C18 RRHD色谱柱（2.1 mm x 100 mm，1.8m），以乙腈-0.1甲酸水为流动相进行梯度洗脱。质谱分析采用电喷雾正离子全扫描模式采集，扫描范围为m/z 100-1500Da。结论：本文通过UPLC-Q-TOF-MS对功能红曲粉的不同溶剂提取物的化学成分进行定性分析与比较。鉴定出17种主要的莫纳可林类物质。该方法快速、可靠、高效，能较全面地反映功能红曲粉的的提取物中的主要莫纳可林类物质，可为深入研究功能红曲粉中的药效物质提供参考。关键词：功能红曲粉UPLC-Q-TOF-MS莫纳可林类物质中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）01-0001-05Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.01.01Detection of monacolin in functional red yeast riceLin Jun，Lin Feng，Wu Li-yun*（Fujian Hongqu Microbial Technology Development and Application Engineering Research Center，Fujian Institute of Microbiology，Fuzhou，Fujian 350007，China）Abstract:Objective：To analyze and identify the main monacolins in the solid state fermentation of laboratory-made functional Monascus.Methods：Functional red yeast rice powder was first prepared by solid state fermentation，and then foursolvents（distilled water，ethanol，ethyl acetate and n-hexane）were used to extract functional red yeast rice powder，andthen the extract was prepared by reduced pressure rotary steaming and freeze-drying.The chemical composition of differentsolvent extracts of functional red yeast powder was qualitatively analyzed and compared by UPLC-Q-TOF-MS.AgilentEclipse Plus-C18 RRHD Column（2.1 mm x 100 mm，1.8 m）was used for gradient elution with acetonitrile-0.1%formicacid water as the mobile phase.Mass spectrometry analysis was acquired in electrospray positive ion full scan mode with ascanning range of m/z 100-1500Da.Conclusions：In this paper,the chemical composition of different solvent extracts offunctional red yeast powder was qualitatively analyzed and compared by UPLC-Q-TOF-MS.Seventeen major monacolinswere identified.This method is fast,reliable and efficient,and can fully reflect the main monacolins in the extract of functional red yeast powder,which can provide a reference for in-depth study of the pharmacodynamic substances in functionalred yeast powder.Key words：Functional Red Yeast rice UPLC-Q-TOF-MS Monacolins研究报告12023，32（1）福建分析测试研究报告功能红曲米是以大米为原料用红曲霉发酵生成的含发酵自然产生的莫纳可林 K（Monacolin K（MK）等生物活性物质的红曲。功能红曲米具有多种生物活性，如调节血脂，抗肿瘤、抗氧化及抗糖尿病等1-3。20世纪70年代日本学者Endo4首次从红曲霉菌培养液中分离出Monacolin K。MonacolinK通过与体内的 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）产生竞争性抑制作用，能有效抑制胆固醇的体内合成5。功能红曲能明显改善高脂血症大鼠血清总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT），碱性磷酸酶（AKP）的水平。有研究在对比化药他汀和功能红曲米的降胆固醇作用时发现，在起到相同的降胆固醇作用时，红曲米中的MK含量显著低于化药他汀中的MK含量6。本研究室之前通过大鼠实验研究同样发现，在高脂血症大鼠TG、AST调控方面上，同等剂量下功能红曲优于洛伐他汀7。这可能是因为功能红曲米中除了MK外，还有多种莫纳可林类化合物同样能起到降胆固醇的作用。目前发现的红曲中的莫纳可林类物质有39个8。莫纳可林类化合物是一种聚酮类化合物，为针状透明晶体，水中溶解度低，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂9。提取功能红曲米活性成分的溶剂主要是甲醇、乙醇的水溶液。为了更加全面的分析功能红曲中的莫纳可林类物质，本研究以实验室保藏的红曲霉菌在一定条件下发酵制得的功能红曲米为原料，利用极性不同的4种溶剂（蒸馏水、乙醇、乙酸乙酯和正己烷）分别对功能红曲米中莫纳可林类物质分别进行提取，并使用UPLC-Q-TOF-MS 分析鉴定主要的莫纳可林类物质，旨在尽可能全面的分析样品中的莫纳可林类物质，为功能红曲粉中的活性成分的研究开发提供有益参考。1实验部分1.1仪器、试剂与材料Agilent 1290 高效液相色谱系统；Agilent 6545Q-TOF质谱仪（电喷雾离子源，正离子模式）；微型植物试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；KQ-5200DE数控型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XSE105 分析天平（Mettler Toledo 公司）；Milli-Q超纯水仪（Millipore公司，USA）；高速离心机（美国Beckman公司）。种子培养基：葡萄糖 5 g，蛋白胨 1.5 g，酵母粉1.0 g，硫酸镁0.05 g，磷酸二氢钾0.1 g，硝酸钠0.3 g固体发酵培养基：将50 g大米浸泡过夜，沥干装入500 mL三角瓶中，蒸熟后搅拌至松散再经121灭菌30 min。试剂：乙醇，乙酸乙酯，正己烷均为分析纯，Monacolin K（即 洛 伐 他 汀）标 准 品（批 号：100600201003）购自中国食品药品检定研究所，含量为 99.4%，乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国 Merck公司），乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水由Milli-Q制备。1.2方法1.2.1功能红曲米的制备固态发酵：用无菌水冲洗红曲菌斜面孢子至带玻璃珠的三角瓶中，再用玻璃珠将孢子打散制成106cfu/mL孢子悬液以 2接种量将菌悬液接人种子培养基中，30、120 转/分钟振荡培养48 h将生长好的种子液以10接种量转接于固体培养基中，将培养温度由30逐步降至24，变温发酵至第26天结束。1.2.2红曲提取物的制备样品溶液的制备：将红曲米粉碎过40目筛，称取四份100g红曲粉，分别用加入蒸馏水，乙醇，乙酸乙酯，正己烷，水浴超声 60 分钟。取提取液离心4000转/分钟，10分钟，取上清液，减压旋蒸浓缩，收集浓缩液，低温冷冻干燥，获得红曲水提物冻干粉（A）、乙醇提取物冻干粉（B）、乙酸乙酯提取物冻干粉（C）和正己烷提取物冻干粉（D）。1.2.3供试品溶液的配制分别称取A、B、C、D四个样品10mg于5mL离心管中，加入70%甲醇，水浴超声30分钟溶解，0.22m过滤头过滤，稀释十倍于样品瓶中后上机检测1.2.4对照品溶液的配制称取 Monacolin K 1.1114g，用无水乙醇定容于10mL容量瓶中，0.22m过滤头过滤，稀释十倍于样品瓶中后上机检测。1.2.5色谱及质谱采集条件22023，32（1）液相色谱条件：谱柱为Agilent EclipsePlus C18RRHD柱（2.1 X 50 mL，1.8m）；流动相A为01甲酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0-20 min，5-35%B；20-30 min，35-50%B；30-45 min，50-68%B；45-50 min，68-75%B；50-60 min，75-90%B，60-65 min，5%B。流速：0.4 mI/min，柱温：40，DAD（G7117A）检测，进样量1L。质谱条件：ESI离子源，采用正离子检测模式；鞘气温度：350，鞘气流速：8 L/min；喷嘴电压：1000 V；毛细管电压：3500 V；雾化气压力：0.24 MPa（35 psi）；干燥气温度：320，干燥气流速：8.0 L/min；毛细管出口电压：135 V；Skimmer电压：65 V；八级杆电压：750 V；碰撞能量（CE）：15-40 V；全扫描模式采集，扫描范围：m/z 100-1500Da。1.2.6数据处理使 用 仪 器 MassHunter Qualitative AnalysisB.07.00软件对各峰对应的母离子进行分析，根据精确质量数，推测可能的分子式，并结合对其碎片离子的分析，与数据库 MassBank（http：/www.massbank.jp/）、HMDB（http：/www.hmdb.ca/）进行比对。再对各峰进行积分和校正，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量，并以Monacolin K标准品进行单点定量，导出数据，使用HemI 1.0.3.7做热图分析。2结果与分析2.1功能红曲米不同溶剂提取物中莫纳可林类化合物的鉴定采用参比溶液校准仪器质量数后，取供试品溶液进行测定，得到正离子模式下的总离子流图（见图1）。样品经全扫描后，获得提取液中各色谱峰的保留时间、准分子离子峰及MS/MS碎片离子的