DB63T 1348-2015马铃薯茎尖超低温离体保存技术规范.pdf

DB63/T1348-20151.5mm-2.00mm。剥离后的茎尖立即置于保存液中，保存液成分：0.10mol/L蔗糖+MS基础培养基，p5.8,高温灭菌。3.3茎尖预培养将保存液中的茎尖在预培养基上培养4h。预培养基的成分：MS基础培养基+0.04mg/LKT+0.10mol/L蔗糖、pH5.80,过滤灭菌。3.4装载处理将经过预培养的茎尖在室温下浸泡于装载液中进行装载处理，装载时间为40mi。装载液的成分：MS基础培养基+2.00mol/L甘油+0.400mol/L蔗糖，pH5.8,高温灭菌。3.5玻璃化茎尖经过装载处理后，用滤纸吸去残留的液体，放入经过0预冷的玻璃化液中，冰浴30m-40min。玻璃化液成分：MS基础培养基+30.00%甘油+15.00%乙二醇+15.00%二甲基亚砜+0.40mol/L蔗糖，PH5.80,高温灭菌。3.6保存将按4.1-4.5条处理后的茎尖，装入1.80L的冷冻管中，加入新的玻璃化液后注入液氮，盖上盖子迅速投入液氮罐中进行保存。超低温保存技术注意事项，见附录1。4恢复培养与检测4.1化冻、洗涤技术将冷冻管从液氮中取出，室温下将冷冻管打开盖子后注入恢复培养液90s左右，用吸管吸出解冻液体，加入恢复培养液，轻微混匀，在第5min、15min时更换新的恢复培养液，第25min用滤纸吸去茎尖上的恢复培养液，将茎尖转接在恢复培养基中。恢复培养液成分：MS基础培养基+1.2mo1/L蔗糖，pH5.8:恢复培养基成分为：MS基础培养基+12.00mol/L蔗糖+0.5mg/LIAA+0.04mg/LKT+0.1mg/LGA3,plH5.80。4.2恢复培养条件恢复培养条件：暗培养10d,弱光条件（光照5001xS001x)下培养10d,正常条件20001x-30001x。培养温度均为21.002.00。4.3成苗率统计茎尖在恢复培养基上培养40d后观察成苗率。经恢复培养后，茎尖发育成苗的百分率不能低于40%。4.4抽检每半年抽检一次，当成苗率低于20%时，该批次材料淘汰。2