DB65T 3501-2013绵羊卵母细胞体外受精技术操作规程.pdf

DB65/T3501-2013箱应放置在实验室空气流动小、人员少去的部位。对培养箱的温度、湿度和CO水平应每周进行监控和调节，通常每半年消毒一次。4.2.3实验室：胚胎/卵母细胞专用。应光线充足、清洁无尘，备有应急照明灯，实验室顶棚和墙壁的材料应无孔隙，其表面必须密封。通风系统采用高效微粒过滤，通风装置至少每周消毒一次，非工作人员限制入内，具体方法见附录C(规范性附录)。4.2.4实验室、采卵室等场所应保持整洁，使用前必须消毒。5卵母细胞收集5.1收集卵巢在屠宰后的绵羊里找到卵巢，将卵巢剪下来放到保温瓶的A液里，A液维持在(3037)之间，恒温保存，收集时间不能超过1.5h,收集后送回实验室进行体外成熟。5.2抽卵将针头从透明的卵泡边缘插入，不宜太深，边抽边轻晃，吸出卵母细胞，每吸35枚后，吸少量抽卵液，以防卵母细胞粘附在针管壁上，再将抽取的卵母细胞混合液注入有2ml抽卵液的试管中，恒温保存，用2、3个注射器交换抽卵；抽完一侧卵巢再抽另一侧卵巢的卵母细胞，抽完后回实验室拣卵。5.3拣卵从培养箱中取出90mm培养皿和三个加抽卵液的小皿，将加抽卵液的小皿先放入恒温板上充有5%CO2气体的黑盒子中。再用1ml移液枪将带有卵母细胞的回收液移入90mm培养皿中（转移时从管底吸取液体)，进行镜检迅速将拣出的卵母细胞移入1号皿中，将1号皿放入黑盒子中，然后复检90mm皿，确认卵母细胞已全部拣出，再继续将剩余的回收液进行拣卵。5.4洗卵将1号皿中的卵母细胞反复吹吸(35)次，然后移入2号皿中冲洗，最后将所有的卵母细胞集中到3号皿，放回培养箱。5.5入孵从培养箱中取出二个成熟液洗皿和成熟皿放入恒温板的黑盒子里，将3盘卵母细胞移入盛有成熟液的4盘和5盘中，冲洗两次，然后将冲洗好的卵母细胞分级（详见附表4），移入到成熟皿中，每个孔中30枚卵母细胞，在成熟皿盖上标出供体羊号码和每孔中卵母细胞数量。然后放入培养箱中进行成熟培养“培养条件：5%CO2、38.6、(2224)h”。6体外受精(IVF)6.1精液的采集、稀释与获能6.1.1准备工作6.1.1.1消毒：将集精杯，带刻度的玻璃试管，200ml烧杯，高温高压消毒。6.1.1.2打开恒温水浴锅，将温度调在(3637)。6.1.1.3将带刻度的玻璃试管和载玻片放在恒温板上预热。6.1.1.4将精液稀释液移入14ml带盖的试管中，放在水浴锅内的试管架中，预热。6.1.2采精6.1.2.1根据供体羔羊育种计划要求和采集卵母细胞体外受精的需要，确定所采种公羊的数量。6.1.2.2根据绵羊人工授精操作规程要求采精。6.1.2.3选用符合要求已生产的冷冻精液。6.1.3精液的稀释6.1.3.1根据绵羊人工授精操作规程要求检查精子活力、密度。6.1.3.2配制牛奶卵黄稀释液，并在恒温水浴锅中预热。6.1.3.3精液品质较好的可以稀释(56)倍，如精液品质稍差，可以降低稀释的倍数。2DB65/T3501-20136.1.3.4精液稀释是在水浴锅中进行，用移液枪轻轻将精液移入预热好玻璃试管中，并读取刻度，确定加入精液稀释液的量，移液枪吸取已预热稀释液，轻轻打入玻璃管底部（切忌用力过猛和一次全部将稀释液打入)，然后从液面吸取部分，再将移液枪伸入管底，打出部分，这样反复吸打混匀。然后再吸取部分稀释液，操作同上，直到达到所要稀释的刻度。6.1.3.5用铝箔纸包好精液管，标出种羊的号码和日期；放入200ml水浴锅温水烧杯中，置于4的冰箱中过夜获能备用。6.2体外受精的准备62.1在体外受精前一天，配制体外受精液，放入冰箱冷藏中。6.2.2受精前(23)，平衡受精液。培养皿盖上标出，IVP和日期；将受精液点入培养皿中，每个培养皿7个滴，每滴加50l受精液，覆盖3ml石蜡油，放入培养箱中平衡。6.23洗皿用记号笔标上1、2和3，每皿加入2ml的受精液：同时准备一个空皿，放入培养箱平衡。6.2.4精液上浮管按照每2个培养滴一个试管，每管移入0.5ml的受精液，放入培养箱中平衡。62.5用75%的酒精喷体视镜上的恒温板与体视镜周围的台面上，然后用已消毒过的纸巾擦干。6.2.6在酒精灯上拉直径小于250m的吸管，并在体视镜下检查管口是否平整，放好备用；用于吹打掉卵母细胞周围已扩散的部分颗粒细胞层。6.3精液上浮6.3.1准备工作63.1.1恒温水浴锅准备，检查恒温水浴锅中水量，打开，定温到(3637)。6.3.1.2将8ml玻璃试管和载玻片放在恒温板上预热。6.3.2精液上浮6.3.2.1在体外受精前30min,将8ml玻璃试管置于水浴锅内.6.3.2.2从4冰箱取出精液（带烧杯一起取出），用移液枪从中移出300l,慢慢放入水浴锅内的试管底部，轻轻摇动试管，均匀受热(3040)s后。6.3.2.3检查精液的品质，如精液品质良好，用移液枪移取50l,轻轻打入培养箱内精液上浮管中（移液枪头放至管底，每管50ul),放入培养箱中，上浮时间最少20min,切忌振荡上浮管。6.4体外受精(IVF)6.4.1根据入孵的时间依次进行体外受精。6.4.2将3个受精液洗皿和受精盘取出，放入加热台的黑盒子里；将受精液液体倒入空皿(H皿)。6.4.3从培养箱中取出成熟盘，放在体视镜下观察卵母细胞的成熟情况，成熟后的卵母细胞颗粒细胞发生扩散。6.4.4用吸管将四孔盘中成熟的卵母细胞移入H盘中，对卵母细胞稍微吹打，迅速移入1号受精液洗皿中，将1号受精液洗皿放回黑盒子，检查四孔盘中是否还有未吸出的卵母细胞：然后将1号受精液洗皿中的卵母细胞移入2号受精液洗皿，再移入3号受清液洗区，最后移入受精培养皿中，放回培养箱。6.4.5用移液枪从精液上浮管的最上层移取(5080)l上浮精液密度约210个，最终密度每ml为210个，轻轻打入受精滴中，标住每孔的卵母细胞数量、公羊号，放入培养箱培养条件：5%C02、38.6、(2630)h。记录VF时间，填写附表4。6.4.6体外受精时，每滴最多放入30枚卵母细胞。7胚胎的体外培养(IVC)7.1准备工作7.1.1将培养液放入培养箱中，松开瓶盖，平衡23h。7.1.2胚胎培养液洗皿的准备，每皿2ml培养液，放入培养箱中平衡。7.1.3将培养液移入四孔盘中，每孔500l,加盖300l矿物油，标出IVC和日期，放入培养箱中平3