DB37T 3128.1-2018I群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定.pdf

DB37/T3128.1-2018)商品化的FITC标记鼠抗兔荧光抗体：g）兔抗群禽腺病毒多克隆抗体（灭活疫苗免疫兔制备）：h)50%甘油：i)商品化的DNA提取试剂盒：j)rTaq DNA聚合酶(5U/uL):k)10XPCR Buffer;1)dNTPs(2.5 mmol/L):m)商品化的DNA分子量标准，要求在100bp2000bp之间，有5条以上的指示条带：n)1.5%琼脂糖凝胶，见B.1:o)1XTE缓冲液，见B.2:p)溴化乙锭(10g/L),见B.3:q)核酸电泳加样缓冲液，见B.4:r)商品化核酸凝胶纯化试剂盒：s)DNA限制性内切酶Hae II:t)阳性对照标准品，I群禽腺病毒细胞培养物：)阴性对照标准品，高压灭菌的蒸馏水：v)本标准中使用的水均按照GB/T6682制备和使用：w)SPF鸡胚：x)LMH细胞：y)Hexon基因扩增引物。FAV-AF:5-TGGACATGGGGGCGACCTA-3:FAV-AR:5-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3,扩增片段A长度约为1210bp:FAV-BF:5-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3FAV-BR:5-TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3,扩增片段B长度约为1350bp.上述引物浓度均为50mo1/L。5样品采集与处理5.1样品采集采集疑似I群禽腺病毒感染死亡家禽肝疵、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理：活禽采集泄殖腔拭子。样品置于密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4，时间不超过24。5.2样品保存5.2.1室温条件下样品在1h2h内处理完毕，未能及时处理的样本在A冰箱中存放，不超过24h:也可于-20低温条件下保存，不超过30d:-70贮存最佳，不超1年。5.2.2组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20低温条件下保存，不超过2周：-70贮存不超过30d。5.3样品处理5.3.1在生物安全柜中，取10g20g样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。5.3.2用含有抗生素（青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50g/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)等渗磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.07.4，附录A.1)配成10%20%(g/mL)的悬液：泄殖腔拭子悬液中抗生素浓度提高5倍。加入抗生素后川调至7.0一7.4。3