DB35T 2034-2021鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断技术.pdf

DB35/T2034-2021前言本文件按照GB/T1.1一2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院提出。本文件由福建省农业农村厅归口。本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、龙岩市动物疫病预防控制中心、福州市动物疫病预防控制中心、三明市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、陈长福、刘道泉、陈小丽、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈红梅、傅秋玲、江南松、李中华。IIDB35/T2034一2021基因进行分析比较发现，强毒株基因长度为1002bp,而弱毒株L基因长度为474bp,且与强毒株L基因相比具有528bp核苷酸序列缺失。6聚合酶链反应6.1主要仪器设备6.1.1PCR仪。6.1.2高速台式冷冻离心机。6.1.3微量移液器。6.1.4组织匀浆器。6.1.5电泳仪。6.1.6电泳槽。6.1.7紫外凝胶成像系统。6.2试剂6.2.1水，应符合GB/T6682所规定一级水的要求6.2.2磷酸盐缓冲液，配置方法应符合附录A中A.1的规定。6.2.310%十二烷基磺酸钠溶液，配置方法应符合附录A中A.2的规定。6.2.4蛋白酶K溶液，配置方法应符合附录A中A.3的规定。6.2.53N乙酸钠溶液，配置方法应符合附录A中A.4的规定。6.2.61TAE电泳缓冲液，配置方法应符合附录A中A.5的规定。6.2.71.0%琼脂糖疑胶，配置方法应符合附录A中A.7的规定。6.2.810加样缓冲液，配置方法应符合附录A中A.8的规定。6.2.9引物(Primer):10mol/L。根据鸭瘟强弱毒的L2基因保守区设计，对鸭瘟强弱毒扩增片段大小分别为1019bp和91bp。上游引物UL2F:5-TAACG1 CGTTTATACTGTTCCAC-3。下游物UL2R:5-AGACCCAAATGACAGAACCT-3。6.3样品处理将采集的组织（肝脏、食道粘膜假膜）经剪碎处班后，与磷酸盐缓冲液按体积比1：3的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，4000r/min离心30min,取上清液冻存分装备用。6.4核酸DNA提取6.4.1取420L组织匀浆上清液和30L核糖核酸酶加入1.5mL灭菌离心管泥匀后，室温(2025)作用20min。6.4.2加入40L10%十二烷基磺酸钠溶液和10L蛋白酶K溶液，56水浴2。6.4.3加入等量的Tris饱和酚，颠倒充分混匀，12000r/min离心5min,小心吸取上层水相于另一1.5mL灭菌离心管中。6.4.4加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇(25：24：1)，颠倒充分混匀，12000r/min离心5min,小心吸取上层水相于另一1.5mL灭菌离心管中。6.4.5加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20放置1h。2