DB3301T 1096-2018南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法.pdf

DB3301/T1096-2018南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法1范围本标准规定了南美白对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)聚合酶链式反应(PCR)检测的材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于南美白对虾肝肠胞虫的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3检测材料3.1水符合GB/T6682中一级水的要求。3.2Tag酶-20保存，避免反复冻融。3.3 dNTPs含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L,-20保存。3.4引物有两对引物，浓度均为25“moL,其序列分别为：FI:5-CAG CAG GCG CGA AAA TTG TCC A-3R1:5-AAG AGA TAT TGT ATT GCG CTT GCT G-3,扩778bp的片段：F2:5-CAA CGC GGG AAA ACT TAC CA-3*R2:5-ACC TGT TAT TGC CTT CTC CCT CC-3,扩增上述片段中的176hp片段。3.5DNA分子量标准推荐使用DNA1 adder100,各片段大小依次为：1500bp,1000bp,900bp,700bp,600bp,500bp,400 bp,300 bp,200 bp,100 bp.3.6无水乙醇分析纯，使用前-20预冷。1DB3301/T1096-20183.7矿物油无DNA酶和RNA酶。4仪器和设备4.1PCR扩增仪4.2电泳仪输出直流电压0V600V。4.3水平电泳槽50mL500mL,带有凝胶船及样孔梳。4.4移液器量程0.5L10L、10L100L、100L1000L移液器各1支及适配吸头，0.5L10L移液器建议使用带滤芯吸头。4.5紫外透射仪或凝胶成像仪可遮挡可见光干扰，在230nm300nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相功能。4.6恒温培养箱4.7冰箱具冷藏箱，并带-20以下冷冻箱体。4.8离心机转速可达15000/min以上。5操作步骤5.1采样将待检虾置于采样容器内，加10倍体积以上的95%乙酝，没过待检样，常温保存，可保存30d。采样数量应符合SCT7103水生动物产地检疫采样技术规花的要求5.2样品处理将待检虾置于灭菌滤纸上，滤干乙醇。幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体。大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺组织。充分研磨混匀后取10mg50mg的样品，置于1.5mL的离心管中，立即进行DNA抽提。5.3DNA抽提加150 L CTAB溶液（见附录A.1),研磨成糊状后再加CTAB溶液至900L。混匀后于25作用2h。加600L抽提液1（见附录A.2),充分混合30s:12000r/min离心5min,取上层水相：加700uL抽提2