DB32T 4395-2022小麦土传病毒病病原检测技术规程.pdf

IDB32/T4395一2022间接ELISA,首先将受检样品包被固相载休，经洗涤，加入特定的抗体，若受检样品中含有相应的抗原，则会形成待测抗原-抗休复合物，再经洗涤后，加入酶标抗休，以形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，然后加入酶反应的底物，通过测定颜色反应的深浅，定性或定量分析受检样品中的抗原量。4.2Dot-ELISA原理硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下可有效地吸附蛋片质等生物大分子，并保持其免疫活性。将抗原吸附在硝酸纤维素膜表面，利用膜作为固相载休进行抗原抗休反应，通过与相应的抗体和酶标抗抗体的一系列免疫反应，形成抗原抗休-酶标抗抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被催化出现颜色反应产生有色物质并沉着于抗原抗休复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的斑点，可通过肉眼观察斑点的出现与不和颜色深浅程度判定受检样品中是否存在特定抗原及其浓度。4.3RT-PCR原理将逆转录(RT)和聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。逆转录是在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成与之互补的DNA(complementary DNA,cDNA)的过程，再利用特异性引物以cDNA为模板在DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，依据是否能扩增出日的片段大小的PCR产物进行结果判定。5设备和试剂5.1设备酶标仪、洗板机、微量天平、台式离心机、水浴锅、冰箱、一80C低温冰箱、磁力搅拌器、高压灭菌锅、微量移液枪、96孔酶标板、硝酸纤维素膜、培养皿、冰盒、紫外分光光度计、PCR仪。5.2试剂间接ELISA的检测试剂，按照附录A。Dot-LISA的检测试剂，按照附录B。RT-PCR的检测试剂，按照附录C。除另有找定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。5.3对照田间采集疑似小麦黄花叶病和中d小麦花叶病的小麦病株，采用附录C中的特异性引物进行RTPCR检测，得到的扩增产物长度为124bL的，小麦样品则认定为感染WYMV的阳性样品，得到的扩增产物长度为182bp的小麦样品则认定为感染CWY的阳性样品；没有出现日的产物的小麦植株叶片则认定为阴性样品，阳性样品和阴性样品存放于-(C低尚冰箱：间接酶联免疫吸附剂测定和斑点酶联免疫吸附剂测定中，样品提取缓冲液作空白对照，RT-P(检方法中无菌水作为空白对照。6间接ELISA6.1取样田间剪取待测样品叶片，锡箔纸包裹后放入0C冰盒中。6.2样品制备待检测样品按1：10（克：毫升）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/min离心3min,上清液即为制备好的检测样品。对照样品做相同处理。2IDB32/T439520226.3加样在96孔酶标板上加入6.2制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照及样品提取缓冲液，每孔加样100I,加盖，37C孵育1h或4C冰箱孵育过夜，每个样品重复3次。6.4洗板孵育结束后，用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PBST)清洗酶标板3次5次。每孔每次加PBST洗液700ul.,每次停留1min2min。6.5加抗血清用相应病毒抗血清和抗休稀释缓冲液按照1：2000的比例稀释，每孔加入稀释好的抗体液100,加盖，37C孵育1.5h。6.6洗板同6.4。6.7加酶标抗体用抗休稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100：I/孔，加盖，37C孵育1.5h。6.8洗板同6.4。6.9加底物缓冲液将现配的底物缓冲液按100l./孔，加入到酶联板中，室温避光孵育15min30min。6.10终止反应加入2ml.硫酸，50l/孔，终止之应。6.11读数用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值()I)6.12结果判定6.12.1首先读取对照孔的(OD值（缓冲液、阴性对照、阳性对照），应该在际量控制范围内。缓冲液孔的OD值0.15，阴性对照孔的ODs值0.15，当阴性对照孔的OD值2，孔的重复性基本一改。6.12.2在满足了6.12.1质量控制要求后，可根据如下数据判断结果：样品OD值/阴性对照(ODo值2，判为阳性：样品OD值/阴性对照OD2,判为阴性；样品OD值阴性对照(OD值在1.52.0,判为可疑样品，需重新检测一次，或用其他方法验证。