DB21T 3273-2020猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法.pdf

DB21/T3273-20205.1 DNAzol Reagent:商品化DNA提取试剂，2C8C普通冰箱中保存；或商品化核酸提取试剂盒（如磁珠法核酸提取试剂），通常1825保存。5.2无水乙醇：-20普通冰箱中预冷。5.375%乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制，-20普通冰箱中预冷。5.4PBS:磷酸盐缓冲液(0.02mo1/LpH7.2),配制见附录A。5.58mmol/LNa0H溶液，配制见附录A。5.62 X TaqMan Fast qPCR Master Mix:为商品化探针法实时荧光PCR反应专用试剂，包含反应所需的缓冲液、酶、dNTP、Mg+等的预混液，-20C普通冰箱中保存，避免反复冻融。5.7引物和TaqMan探针，序列见附录B。5.8阳性对照和阴性对照：阳性对照使用PRv野毒株细胞培养物、Bartha-K61疫苗毒，阴性对照采用灭菌双蒸水或健康猪的组织材料。5.9除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。6样品采集、处理和运输6.1采样前准备6.1.1采样人员参照NY/T541中第5.1条的要求。6.1.2采样工具和器材参照NY/T541中第6.10.3条的要求。6.2样品采集6.2.1血液：参照NY/T541中第6.条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注入含1/10体积4%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编子备检。6.2.2组织脏器：参照NY/T541中第6.2条和6.3条中的要求进行，将采集的病死猪或剖杀猪主要脏器（脑组织、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等)或泻体采集的扁桃体装入灭菌的15L50L离心管中，编号备检；组织脏器使用组织研磨仪或研钵进行处理后用于核酸提取，6.2.3精液：参照NY/T541中第6.10.3条中的要求进行。6.2.4鼻腔拭子：参照Y/T541中第6.4条中的猪鼻腔拭子采集要求进行，将拭子样品放入PBS缓冲液(0.02mol/LpH7.2)中，编号备检。6.2.5细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次，第3次解冻后，44000g离心10min,取上清转入新的无菌无DNA酶的1.5mL离心管中，编号备用。6.3样品保存、包装和废弃物处理参照NY/T541中第7条的要求。2