周氏啮小蜂对阿维菌素胁迫响应的转录组分析_金欣.pdf

Transcriptome analysis of Chouioia cunea Yang in responseto avermectin stressJIN Xin1，2，QIN Dongyu1，2，LIU Xinyu1，2，ZHANG Tiantian1，2，REN Rui1，2，GUO Meiqi1，2，LI Min1，2，ZHU Gengping1，2，PAN Lina1，2（1.College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization ofAnimal Diversity，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）Abstract：To explore the stress effect of pesticides widely applied in agriculture and forestry on Chouioia cunea Yang，thesafety of avermectin，which is a kind of antibiotic insecticide，on C.cunea was assessed by the method of film bioassay.Transcriptome sequencing was used to analyze the alternation of certain gene expression of C.cunea under avermectin stress.The results showed that：Because of the low toxicity of avermectin with the concentration used in the field to C.cunea，avermectin is considered to be a low risk pesticide，while high concentration stress had short-term killing effect on C.cunea；Compared with the control group，a total of 805 differentially expressed genes were obtained by transcriptome sequencing ofC.cunea under avermectin stress with LC10and LC30concentrations，of which 33 genes were up-regulated and 772 genes weredown-regulated；The functional analysis of Gene Ontology（GO）annotation revealed that the corresponding differentiallyexpressed genes were enriched in cell process，metabolic process，membrane and membrane components，molecular bindingand catalytic activities；The analysis of KEGG metabolic pathway demonstrated that the interaction of neuroactive ligand-receptors and the cytochrome P450-induced drug metabolizing pathway were significantly enriched；Detection of cytochromeP450-related genes by RT-qPCR showed that the expression levels of CcCYP9AG3 and CcCYP9AG4 were significantly higherin the avermectin stress group than in the control group，which indicated that the cytochrome P450 gene family，in particular，the CYP9 family is involved in the response of C.cunea to avermectin stress.Keywords：Chouioia cunea Yang；avermectin；toxicity determination；stress response；transcriptome sequencing周氏啮小蜂对阿维菌素胁迫响应的转录组分析金欣1，2，覃东玉1，2，刘新宇1，2，张天天1，2，任睿1，2，郭美琪1，2，李敏1，2，朱耿平1，2，潘丽娜1，2（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市动物多样性保护与利用重点实验室，天津300387）摘要：为探究农林生产常用杀虫剂对周氏啮小蜂的胁迫效应，通过药膜法评估阿维菌素对周氏啮小蜂的安全性，并利用转录组测序分析阿维菌素胁迫下周氏啮小蜂的基因表达变化.结果表明：田间使用浓度的阿维菌素对周氏啮小蜂的毒力作用较低，属于低风险性农药，高浓度阿维菌素胁迫对周氏啮小蜂有短期触杀作用；与对照组相比，LC10和 LC30浓度阿维菌素胁迫下，对周氏啮小蜂进行转录组测序共获得 805 个差异表达基因，其中 33个基因表达上调，772 个基因表达下调；GO 功能分析结果表明，差异表达基因在细胞过程、代谢过程、膜和膜成分、分子结合和催化活性方面均显著富集；KEGG 代谢通路分析结果显示，神经活性配体-受体相互作用以及药物代谢细胞色素 P450 代谢通路显著富集；对细胞色素 P450 相关基因的 RT-qPCR 检测发现，与对照组相比，阿维菌素胁迫下 CcCYP9AG3 和CcCYP9AG4 的表达水平显著上升，说明细胞色素 P450 基因家族尤其是 CYP9 家族参与了周氏啮小蜂对阿维菌素的胁迫响应.关键词：周氏啮小蜂；阿维菌素；毒力评估；胁迫响应；转录组测序中图分类号：Q966文献标志码：A文章编号：1671-1114（2023）01-0022-08收稿日期：2022-02-13基金项目：国家自然科学基金资助项目（31702058）；天津市教委科研计划项目（2019KJ089）；天津市应用基础计划项目青年项目（18JCQNJC84700）.第一作者：金欣（1996），女，硕士研究生.通信作者：潘丽娜（1982），女，副教授，主要从事昆虫分子生物学方面的研究.E-mail：.第 43 卷第 1 期2023 年 1 月天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）Journal of Tianjin Normal University（Natural Science Edition）Vol.43 No.1Jan.2023doi：10.19638/j.issn1671-1114.20230105第 43 卷第 1 期国际检疫性害虫美国白蛾 Hyphantria cunea（鳞翅目：裳娥科1）具有食性杂、取食范围广、危害面积大等特点，在发生严重区域通常以化学防治为主.在田间或林间喷洒杀虫剂虽可以直接杀死大部分害虫，但由于害虫种群内个体间接触药剂的时间或剂量不同，会导致害虫对药物产生抗药性，且杀虫剂的频繁或不恰当使用在除去害虫的同时也会损伤天敌昆虫2.周氏啮小蜂（Chouioia cunea Yang）（膜翅目：姬小蜂科）是美国白蛾 32 种天敌昆虫中最重要、寄生率最高的一种.在美国白蛾不同时期于林间释放周氏啮小蜂均能得到较好的防治效果，且对环境和其他生物无任何不利影响3.阿维菌素（avermectin）是由灰色链霉菌 Strepto-myces griseus 产生的一组大环内酯类物质，是微生物源广谱杀虫剂，主要通过阻断害虫神经元之间的兴奋传导破坏中枢神经，使虫体麻痹死亡4-5.在林间采用合理的稀释浓度和喷洒方式，可对美国白蛾产生良好的杀虫效果，作用效果优于灭幼脲、苏云金杆菌等杀虫剂6-8，且天敌昆虫受阿维菌素的影响较小9.阿维菌素对美国白蛾天敌昆虫周氏啮小蜂的毒力评估以及解毒代谢等尚未见报道.本研究通过药膜法检测不同浓度梯度下阿维菌素对周氏啮小蜂的触杀毒力，并使用亚致死浓度（LC10、LC30）的阿维菌素胁迫处理周氏啮小蜂，通过二代转录组测序分析阿维菌素对周氏啮小蜂基因表达的影响，尤其是细胞色素 P450 酶系相关基因表达的变化.本研究旨在阐明阿维菌素对周氏啮小蜂的安全性以及周氏啮小蜂在基因水平对杀虫剂的抗性作用，为找到农药杀虫剂与天敌间的平衡点，使用综合防治手段防控美国白蛾提供理论依据.1材料与方法1.1实验材料供试昆虫：周氏啮小蜂由河南省漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心惠赠，在天津师范大学动物多样性保护与利用重点实验室进行传代培养.培养条件：人工气候箱（PQX-350H），温度 25，相对湿度 75%，光周期 13L11D.获得成虫后将其接种于柞蚕（Antheraea pernyi Guerin-Meneville）蛹中10，在同样条件下进行传代培养.1.2试剂及仪器3.2%阿维菌素乳油，山东侨昌化学有限公司（田间使用质量浓度为 0.006 0.010 mg/L）；RNA later 样本保存液（AM7020），美国 Ambion 公司；RNA 提取试剂（RNA isolater）、cDNA 反转录试剂盒（HiScriptR 1stStrand cDNA Synthesis Kit）、实时荧光定量 PCR 荧光染料（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix），南京诺唯赞生物科技有限公司.多功能酶标仪（Infinite200），瑞士 Tecan 公司；Li-ghtCyclerR480实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司.1.3方法1.3.1室内毒力评估及安全性评价采用药膜法进行室内毒力评估实验.将 3.2 g/L 的阿维菌素用清水稀释，配制成 2 组质量浓度梯度的药液.高浓度梯度药液的有效质量浓度为 0、4、8、12、16、20 mg/L，低浓度梯度药液的有效质量浓度分别为 0、0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/L.将 40 mL 药液倒入洁净的 50 mL 广口锥形瓶中，静置 5 min，倒出瓶内药液，自然晾干，使药液在管壁上形成一层均匀的药膜.24 h 后接入 1 日龄成蜂 50 头，瓶口用 120 目网布封紧，分别于 1、2、4、6、24 h 后检查并统计瓶中周氏啮小蜂的死亡数量，每个处理重复 3 次.初步确定阿维菌素的毒力，计算使周氏啮小蜂分别死亡 10%、20%、30%、50%的阿维菌素剂量（LC10、LC20、LC30、LC50）.根据资料显示，目前国内外尚无统一评估农药对周氏啮小蜂毒性的标准.周氏啮小蜂为膜翅目昆虫，是一种蛹寄生蜂，赤眼蜂（Trichogrammatid spp.）为膜翅目赤眼蜂科物种，属于卵寄生蜂11，安全性评价标准可参照赤眼蜂进行.根据文献12采用安全系数法：极高风险（安全系数0.05）、高风险（0.05 安全系数0.5）、中风险（0.5 5）.阿维菌素对周氏啮小蜂的安全系数为阿维菌素胁迫下周氏啮小蜂的半致死浓度 LC50与该药的田间推荐使用浓度的比值，即：安全系数=LC50/田间推荐使用浓度.1.3.2全长转录组测定将 200 只自然孵出的成蜂完全浸没于 5 倍