猪源绿色气球菌的分离与鉴定_郭伟娜.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):1 4 1-1 4 4P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e猪源绿色气球菌的分离与鉴定 收稿日期:2 0 2 2-0 2-1 8 基金项目:安徽省教育厅自然科学研究重点项目(K J 2 0 2 0 A 0 0 8 7);安徽科技学院稳定人才项目(D KWD 2 0 1 8 0 1);安徽省教育厅自然科学研究重点项目(K J 2 0 1 6 A 8 2 2);安徽省兽医学重点学科建设项目(AK Z D X K 2 0 1 5 A 0 4)作者简介:郭伟娜(1 9 8 2-),女,河南内黄人,副教授,博士,主要从事病原微生物的分离鉴定及致病性研究。郭伟娜,路振香,陈雪龙,刘 畅,张留君,赵 磊(安徽科技学院动物科学学院,安徽凤阳2 3 3 1 0 0)摘 要:对安徽省凤阳县某生猪养殖场送检的病死猪肝脏样品进行病原的分离与鉴定。将病死猪肝脏组织接种至血琼脂培养基上进行病原菌的分离纯化、染色镜检、生化试验,以及1 6 Sr R NA基因的P C R扩增和测序分析。结果显示,分离菌在血琼脂培养基上呈灰白色、圆形小菌落,菌落周围有草绿色的不完全溶血现象;染色镜检发现分离菌为革兰氏阳性的二联或四联球菌;生化试验表明分离菌对葡萄糖、乳糖和蔗糖均能分解产酸不产气,甲基红试验为阳性,二乙酰和吲哚试验为阴性;P C R测序分析表明,分离菌与猪源绿色气球菌7 1 9菌株的1 6 Sr R NA基因序列(G e n B a n k登录号为:MN 5 1 3 2 2 4)的相似性高达9 9.8 6%,与G e n-B a n k中的1 0株绿色气球菌参考菌株的同源性为9 9.2%9 9.3%,与绿色气球菌的多个菌株位于同一大分支上,遗传亲缘关系较近。结果表明,从养殖场送检的病死猪肝脏组织中分离鉴定出1株绿色气球菌AH-F Y菌株,为该病的临床诊断及防控提供依据。关键词:猪;绿色气球菌;分离;鉴定;1 6 Sr R NA中图分类号:S 8 5 2.6 1 1文献标识码:B文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 1 4 1-0 4 绿色气球菌(A e r o c o c c u sv i r i d a n s)属链球菌科、气球菌属,是一种呈二联或四联方式排列、无芽孢、不运动、兼性厌氧的革兰氏阳性球菌。目前,气球菌属包括8个种1,即绿色气球菌、尿道气球、柯氏气球菌、血气球菌、人尿气球菌、马尿气球菌、猪气球菌、阴道气球菌。绿色气球菌是一种条件致病菌,可引起人的菌血症、心内膜炎、脑膜炎和关节炎等2。兽医临床上该菌可引起奶牛乳腺炎、猪关节炎、猪脑膜炎和猪肺炎等3-4,还可感染山羊、鸡、鸭、竹鼠等动物5-8。猪感染绿色气球菌后主要表现为精神不振、食欲降低、体温升高、气喘、关节肿大,背部、腹部、四肢内侧等皮肤有出血现象,下痢甚至血便等;剖检病理变化主要为心脏和肺脏表面有纤维素性渗出物,心包积液,胸腔积液,腹腔器官有纤维素性渗出物附着,腹腔、关节积液,脾脏肿大,肺脏出血水肿,淋巴结出血等4。目前,国外主要是关于鱼、虾、蟹等水产动物感染绿色气球菌的报道,2 0 1 0年首次从患病的罗非鱼分离到2株绿色气球菌9,但对猪绿色气球菌的研究较少。本研究从某猪场送检的病死猪肝脏组织中进行病原分离培养,以及1 6 Sr R NA基因的P C R扩增与测序分析,为该病的临床诊断及防控提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料来源 安徽省凤阳县某生猪养殖场所送检的病死猪肝脏组织。患病猪临床表现为体温升高,被毛粗乱,气喘,剖检病理变化有淋巴结肿大,气管有黏液及出血,肺脏出血,脾脏肿大,肝脏肿大有出血。1.1.2 培养基及试剂 血琼脂培养基,常德比克曼生物科技有限公司产品;L B肉汤培养基、P C R扩增试剂盒、琼脂糖、5 0T A E缓 冲液、D NA M a r k e rD L20 0 0等,生工生物工程(上海)股份有限公司产品。1.1.3 仪器设备 立式压力蒸汽灭菌器(L D Z X-5 0 F B),上 海 申 安 医 疗 器 械 厂 产 品;电 子 天 平(B S 2 2 4 S),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品;超净工作台(ZWZM-1),上海智城分析仪器制造有 限 公 司 产 品;隔 水 式 恒 温 培 养 箱(G S P-9 0 5 0 MB E),上海森信实验仪器有限公司产品;小型台式高速离心机(5 4 2 4),德国E p p e n d o r f公司产品;P C R扩增仪(E T C 8 1 1),北京东胜生物科技有限公司产品;凝胶成像仪(T a n o n 1 6 0 0),上海天能科技有限公司产品。DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.0051.2 方法1.2.1 分离纯化和染色镜检 用灭菌接种环蘸取病死猪的肝脏组织在血琼脂培养基上划线接种,3 7培养2 4h,挑取单菌落进行纯化培养。然后对纯化的病原菌进行革兰氏染色,镜检观察。1.2.2 生化试验 用接种环或接种针将分离菌分别接种至糖发酵管(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水中,3 7培养2 4h4 8h后,观察糖发酵试验、甲基红试验、二乙酰试验(V P试验)和吲哚形成试验结果。1.2.3 D NA模板的制备 用灭菌接种环挑取单个菌落接种于L B肉汤培养基,3 7、1 8 0r/m i n振荡培养2 4h。之后采用煮沸法提取核酸,即为D NA模板。1.2.4 1 6 Sr R NA基因的P C R扩增及测序分析 参考细菌1 6 Sr R NA基因序列的通用引物,由通用生物系统(安徽)股份有限公司合成,引物序列如下:2 7-F:5 -AGAG T T T GAT C AT G G C T C 3,1 5 2 5-R:5 -AAG GAG G T GAT C C AA C C-3。P C R反 应 体 系 为5 0L:P C R M a s t e r M i x2 5L,上、下引物各2L,D NA模板5L,无菌水1 6L。P C R反应条件:9 55m i n;9 53 0s,5 53 0s,7 21m i n,3 0个循环;7 21 0m i n。P C R产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至通用生物系统(安徽)股份有限公司测序,测序结果在N C B I网 站 上 核 酸 数 据 库 中 进 行 比 对 分 析,用D NA S t a r软件中的M e g a l i g n程序进行同源性分析和遗传进化树的构建。2 结果2.1 分离培养及染色镜检结果分离菌在血琼脂培养基上分离纯化后的菌落特征见图1,其中左图为菌落正面观察结果,右图为菌落背面观察结果。分离菌培养特性主要为表面光滑、湿润、边缘整齐、轻度隆起、灰白色、圆形小菌落,菌落周围有草绿色的不完全溶血现象。分离菌的革兰氏染色镜检结果为蓝紫色的革兰氏阳性球菌,呈二联或四联方式排列,无芽孢。图1 分离菌在血琼脂培养基上的培养特性F i g.1 C u l t u r ec h a r a c t e r i s t i c so f i s o l a t e db a c t e r i ao nb l o o da g a rm e d i u m图2 分离菌革兰氏染色镜检结果(1 01 0 0)F i g.2 M i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o no f i s o l a t e db a c t e r i aw i t hG r a ms t a i n i n g(1 01 0 0)2.2 生化试验结果生化试验结果表明,糖发酵试验中,分离菌对葡萄糖、乳糖和蔗糖均能分解产酸但不产气,培养液由紫色变为黄色;甲基红试验的结果为阳性,培养液由黄色变为红色;吲哚试验与V P试验的结果为阴性,仍为黄色。2.3 P C R扩增及测定分析结果分离菌1 6 Sr R NA基因的P C R扩增产物通过琼脂凝胶电泳检测,发现有一条1 5 0 0b p左右的条带,与目的条带相符(图3)。将分离菌1 6 Sr R NA基因的测序结果在N C B I网站上的核酸数据库中进行序列比对分析,发现其与绿 色 气 球 菌7 1 9菌 株 的1 6 Sr R NA基 因 序 列(G e n B a n k登 录 号:MN 5 1 3 2 2 4)相 似 性 高 达9 9.8 6%。同时将分离菌1 6 Sr R NA基因测序结果(s e q 1)与G e n B a n k中已有的1 0株绿色气球菌参考菌株(表1),用M e g a l i g n进行同源性分析和遗传进化树的构建(图4和图5),图中s e q 1表示本研究中分离菌序列,其他菌株均用G e n B a n k登录号表示。由图4可知,分离菌与参考菌株的同源性为9 9.2%9 9.3%,由图5可知,分离菌与绿色气球菌菌株J CM 2 0 4 6 1、2 1 9、F C 2 5 0 2 6、7 1 9、N B R C1 2 3 1 7、D S D-241动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)PW 4-OH 1 3、S N S K1 0 2位于同一大分支上,遗传亲缘关系较近。结果证实分离菌为绿色气球菌,将菌株命名为AH F Y,将测序结果上传至N C B I核酸数据库中,获得G e n B a n k登录号为OM 2 7 8 2 6 7。3 讨论绿色气球菌是一种条件致病菌,在动物机体抵抗力下降者与其他病原混合感染时会引起菌血症、败血症、脑膜炎、关节炎、乳腺炎等病理变化。绿色气球菌既可以感染幼龄动物,又可以感染成年动物,具有很强的致病性,同时又可以跨种属感染,因此,兽医临床上应多关注该菌的致病性研究。本研究主要是从病死猪的肝脏组织分离到1株绿色气球菌AH F Y菌株,与文献1 0 分离的绿色气球菌组织来源相同。另外,其他动物中也有从肝脏分离绿色气M.D NA标准D L20 0 0;1.分离菌的P C R产物;2.阴性对照M.D NA M a r k e rD L20 0 0;1.P C Rp r o d u c t so fi s o l a t e db a c t e r i a;2.N e g a t i v ec o n t r o l图3 1 6 S rR NA基因P C R扩增结果F i g.3 P C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so f 1 6 S rR NAg e n e表1 绿色气球菌参考菌株信息T a b l e1 R e f e r e n c es t r a i n i n f o r m a t i o no fA e r o c o c u sv i r i d a n sG e n B a n k登录号G e n B a n kA c c e s s i o nn u m b e r菌株名称S t r a i n国家C o u n t r y来源S o u r c eL C 2 5 8 1 5 6J CM 2 0 4 6 1日本J a p a n生物资源中心B i o l o g i c a lR e s o u r c eC e n t e rHQ 9 1 7 0 1 22 1 9斯洛伐克S l o v a k i a奶牛c o wMT 9 0 7 2 6 7F C 2 5 0 2 6中国C h i n a生产线p r o d u c t i o n l i n eMN 5 1 3 2 2 47 1 9韩国K o r e a生物资源中心B i o l o g i c a lR e s o u r c eC e n t e rA B 6 8 0 2 7 1N B R C1 2 3 1 7日本J a p a n生物资源中心B i o l o g i c a lR e s